科研 | 益生菌对多发性硬化症的微生物学和免疫调节作用
本文由李红霞编译，董小橙、江舜尧编辑。
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越来越多的研究表明，肠道微生物群与自身免疫性疾病有关，如：炎症性肠病、类风湿关节炎和多发性硬化症（MS）。对小鼠自身免疫性脑脊髓炎（EAE）多发性硬化症模型的研究表明，肠道微生物群对自身免疫性脑脊髓炎的易感性有影响。另一些研究表明，Bacteroides fragilis定植于小鼠可改善EAE。许多研究者报道了MS患者肠道微生物群的改变，如Methanobrevibacter 的增加与Butyricimonas的降低。最近的研究表明，肠道Th17细胞的高频率出现与肠道微生物组成的改变以及MS疾病活性的增加有关。这些研究表明，肠道微生物群的调节可能对MS患者有潜在的益处。
多菌株益生菌（益生菌LBS）含有8种细菌，应用于动物和人类，具有良好的安全性。益生菌LBS能在小鼠结肠组织模型中诱导IL-10和IL-10依赖的转化生长因子β-调节细胞。此外，LBS还被证明能改善花生过敏和糖尿病小鼠肠道的抗炎反应。最近的一项研究报告了LBS与降低外周血和肠道相关淋巴组织中T细胞活性之间的关系，从免疫调节功能扩展到中枢神经系统。例如，LBS在小鼠创伤性脊髓损伤模型中被证明能促进神经保护。另一项研究报告称，LBS与小胶质细胞活化减少以及CNS单核细胞浸润减少有关，从而改善了小鼠肝脏炎症模型的疾病行为。在人类中，LBS对包囊炎、溃疡性结肠炎和糖尿病患者是有益的，但人们对LBS对人体外周免疫功能的影响知之甚少。本研究旨在探讨LBS对正常人和MS患者肠道微生物群和外周免疫功能的影响。
论文ID
原名：A probiotic modulates the microbiome and immunity in multiple sclerosis
译名：益生菌对多发性硬化症的微生物学和免疫调节作用
期刊：Ann Neurol
IF：10.250
发表时间：2018年
通信作者：Stephanie K. Tankou
通信作者单位：哈佛大学
实验设计
实验内容
为了评估不同采样时间对肠道微生物组成的影响，每个受试者采集6个粪便样本。用Adonis聚类方法进行比较，结果对照组和MS患者的群落结构无显着性差异(P>0.05)。因此肠道微生物组成的时间波动可以忽略不计。
图1：研究设计流程图
为了评估MS患者和对照组微生物群落结构的总体差异，采用α-和β-多样性进行评估。结果显示，服用LBS后对照组α多样性降低（图2B）。服用LBS后MS患者α多样性无明显变化（图2B）。
采用非加权和加权的UniFrac度量方法计算了β多样性的差异，评价微生物群落结构，并通过主坐标分析(PCoA)对群落进行可视化。结果显示，服用LBS后对照组与MS组患者的微生物群落结构改变。
图2：IBS对肠道微生物群α和β多样性的影响
4.1 菌群结构分析
服用LBS后，对照组和MS组乳酸菌、链球菌和双歧杆菌的相对丰度发生了变化（图3A）。值得注意的是，以前有研究报告MS患者乳酸菌属的数量减少。补充LBS后，乳酸菌和双歧杆菌相对丰度的增加可能对MS患者有利。服用LBS后，对照组Veillonellaceae（图3B）和Collinsela（图3C）家族相对丰度增加，这是MS患者肠道耗竭的两个属。补充LBS后，MS患者肠道中Akkermansia（Th1诱导剂）、Blautia和Dorea（图3B-C）减少。在对照组和MS患者补充LBS后，我们还观察到B. adolescentis（Th17诱导剂）的相对丰度下降。因此，补充LBS可以逆转MS引起的肠道微生物组成的改变，并抑制促炎细菌的生长。
图3：LBS对肠道微生物组成的影响
4.2 菌群功能研究
我们根据16S数据使用PICRUSt评估微生物群的功能。服用LBS后，正常人和MS患者KEGG通路的丰度均降低，包括代谢途径、细胞过程途径、环境信息与加工途径和器官系统途径（P<0.05，图4A）。ABC转运蛋白、原核生物的固碳途径、卟啉和叶绿素代谢及产孢途径是MS患者的四种KEGG途径。补充LBS后，这四种途径的丰度降低（p<0.05，图4A）。同时，发现甲烷代谢途径丰度降低（p<0.05，图4A）。因此，这些发现提示LBS可以逆转MS患者肠道微生物群的改变。
对健康受试者和MS患者的粪便进行代谢组学分析。服用LBS后，对照组尿嘧啶（p=0.006）、一磷酸腺苷（p=0.027）、次黄嘌呤（p=0.040）和黄嘌呤（p=0.017）浓度增加（图4B）。停止服用LBS后，我2-氧戊二酸水平（p=0.040）升高（图4B）。在MS患者中，服用LBS后，2-氧戊二酸（p=0.039）（图4B）、3-羟戊酸水平下降（p=0.027）（图4B）。停止服用LBS后，MS患者3-羟戊酸甲酯（p=0.008）、柠檬酸盐（p=0.023）、烟酸酯（p=0.039）和α-酮异戊酸酯（p=0.016）水平升高（图4B）。研究肠道微生物群与代谢物变化之间的潜在联系。结果显示，服用LBS后，在对照组中，Ruminococcaceae OTUs (187225 、36378)与尿嘧啶水平呈正相关（图4C），LactobacillusOTU 304724与次黄嘌呤浓度呈正相关（图4C）。在MS患者中，我们发现以下4种乳酸菌OTUS：288784、134726、4414261和4429553相对丰度的增加与一磷酸腺苷（图4D）之间存在关联，StreptococcusNROTU 985与单磷酸腺苷呈正相关（图4D），双歧杆菌OTU 1142029水平与次黄嘌呤浓度呈负相关（图4D）。在两种乳酸菌OTUS：288784和4429553与羟戊酸盐呈负相关（图4D）。因此，服用LBS后肠道微生物组成的变化与对照组和MS组粪便代谢组学特征的变化有关。
图4：LBS对肠道微生物功能的影响
4.3 免疫细胞分析
采用流式细胞仪检测外周血T细胞频率的变化，结果显示，服用LBS后，对照组CD4+CD127lowCD25HighT regs和CD4+IL-10+T regs的相对频率无明显变化（图5A）。停止服用LBS后，CD4+、IL-10 T regs的相对频率降低（P=0.027，图5 A），CD39+CD127lowCD25HighT regs的相对频率降低（p=0.011，P=0.048，图5B），LAP+T regs的频率下降（p=0.06，图5C）。服用LBS后，MS组患者效应记忆CD8 T细胞的频率增加（p=0.062，图5D）。服用LBS后，在对照组和MS患者中，Th1和Th17细胞的相对频率呈下降趋势。对健康受试者和MS患者外周血单个核细胞中分离的CD4 T细胞进行了高通量的真核生物基因表达RNA-Seq。发现服用LBS后，CD4 T细胞中促炎细胞因子和抗炎细胞因子的表达没有明显变化。
其次，对单核细胞进行免疫细胞谱分析，服用LBS后，发现MS患者中间单核细胞（CD14HighCD16low）的频率降低（p=0.039，图5e），炎症单核细胞频率呈下降的趋势（p=0.068，图5e）。对照组中，服用LBS后，CD 80经典单核细胞上的MFI降低（p=0.035，图5e）。停用LBS后，在MS患者中树突状细胞（CD45lin-CD11c）HLA-DR的MFI降低（p=0.0156，图5f）。
图5：LBS对免疫细胞形态的影响
4.4 基因表达谱分析
用NanoString免疫板对正常人和MS患者外周血单个核细胞进行基因表达谱分析，检测到568个免疫相关基因的表达。正常对照组单核细胞HLA.DQA 1表达降低（P=0.011），单核细胞HLA.DPA 1（p=0.055）和IL6ST（p=0.0039）表达降低（图6A）。停止使用LBS后，对照组HLA.DPA 1和MS危险等位基因HLA.DPB 1的表达增加（分别为p=0.0078和p=0.039；图6A）抗炎基因PTNP 2的表达下降（p=0.0078，图6A）。值得注意的是，LBS停用后， IL6ST表达下降（p=0.039，图6A）、HLA.DQA 1的表达呈下降趋势（p=0.097，图6A）。
接下来，我们研究了肠道微生物群与免疫变化之间的潜在联系。补充LBS后，在肠道中富集的乳杆菌、链球菌和双歧杆菌与促炎作用呈负相关，与抗炎免疫指标呈正相关。我们将粪便代谢物浓度与一组免疫标记物相关联，这些免疫标记物在服用LBS后发生了显著变化。因此，Lactobacillus（乳酸菌）OTU 304724相对丰度的增加与粪便次黄嘌呤水平升高有关，这与单核细胞HLA.DPA 1和HLA.DPB 1表达降低有关。补充LBS后，MS患者粪便代谢产物与免疫指标之间没有明显的相关性。
图6：LBS对外周血单核细胞基因表达谱的影响
结 论
服用益生菌能够增加MS患者中以缺少的菌群，如乳酸菌，降低与MS疾病相关类群的丰度，如：Akkermansia和Blautia。预测元组分析显示，服用益生菌后， MS患者肠道微生物功能相关的KEGG通路的丰度下降。免疫分析显示，益生菌可诱导抗炎性外周免疫反应，抑制炎症因子。
评 论
本研究采用16S rRNA微生物群落分析法、预测元组、代谢组学，基因表达等方法，对服用益生菌的健康受试者与MS患者进行研究，表明服用益生菌能够调整肠道菌群结构，抑制炎症反应。有望通过调整微生物群落，达到治疗疾病目的。
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