科研 | Hepatology: 在原发性硬化性胆管炎小鼠模型中,肠道菌群失调通过NLRP3促进肝病进展

编译:茜茜,编辑:小菌菌、江舜尧。

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导读

目的:人类胆汁淤积性肝病(cholestatic liver disease,CLD)与炎症性肠病(inflammatory bowel disease ,IBD)密切相关。然而,CLD中肠道微生物菌群和炎症体介导的先天免疫反应的功能意义仍然难以捉摸。在这里,我们研究了肠肝轴在MDR2基因敲除小鼠(Mdr2−/−)模型中的功能作用,该模型类似于原发性硬化性胆管炎(primarysclerosing cholangitis,PSC)。
实验设计:Mdr2−/−,Mdr2−/−与肝细胞特异性缺失的Caspase-8(Mdr2−/−/casp8∆HepA)和野生型(WT)对照雄性分别饲养8周或52周,观察Mdr2缺失对小鼠肝脏和肠道胆汁酸及微生物菌群的影响。为了观察阻断半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(caspase)的激活,给予泛caspase抑制剂(IDN-7314)。最后,通过粪菌移植实验,研究了Mdr2−/−在肠道菌群失调中的功能作用。
结果:Mdr2−/−小鼠表现出不良的肠道微生物菌群特征,在肠肝轴中激活炎症小体NLRP3。Mdr2−/−小鼠的肠道菌群失调导致肠屏障功能障碍和细菌移位增加,放大了肝脏NLRP3介导的先天免疫反应。将Mdr2−/−微生物群转移到健康的WT对照组小鼠中,在受体小鼠中诱导了显著的肝损伤,突出了肠道生物失调在疾病进展中的因果作用。值得注意的是,IDN-7314抑制了炎性小体的激活,改善了肝损伤,逆转了血清胆汁酸水平和胆汁淤积相关的微生物菌群特征。
结论:MDR2相关性胆汁淤积可引起肠道菌群失调。反过来,内毒素移位到门静脉和随后的NLRP3炎性小体激活导致更高的肝损伤。这一过程本质上不依赖于肝细胞中的caspase-8,但可以被IDN-7314阻断。

论文ID

原名:Intestinal dysbiosis augments liver disease progression via NLRP3 in a murine model of primary sclerosing cholangitis

译名:原发性硬化性胆管炎小鼠模型中肠道失调通过NLRP3促进肝脏疾病进展

期刊:Hepatology

IF:14.971

发表时间:2019.2.10

通讯作者:lijun liao, Kai Markus Schneide

作者单位:比亚琛工业大学内三科

结果

1.  Mdr2缺乏会导致淤胆性肝损伤,并引发细胞凋亡

结果发现,Mdr2−/−小鼠在8周和52周时血清转氨酶(ALT)水平显著升高,显示严重的肝脏损伤。与WT小鼠相比,Mdr2−/−小鼠显示出更高的肝脏与体重比率。此外,Mdr2−/−小鼠血清胆汁酸浓度显著升高。胆汁酸的合成是哺乳动物胆固醇分解代谢的主要途径;在Mdr2−/−小鼠中,血清胆固醇水平明显降低。Mdr2−/−小鼠的肝脏组织学表现为随着时间的推移(52周)出现强烈的慢性胆管周围炎症反应、进行性胆管增生和门脉周围纤维化。这些数据显示Mdr2−/−肝脏的炎症增加,从而刺激了PSC样表型的进展。

胆汁酸的积聚,特别是那些具有疏水性的胆汁酸,会触发胆汁淤积进而诱导肝细胞死亡。Western blot结果显示Mdr2−/−小鼠肝脏显示明显更高的cleaved caspase-3和caspase-8表达。并且,Mdr2−/−小鼠肝中caspase-3的细胞数量显著增加。受体相互作用蛋白激酶3(RIP3/RIPK3)已经成为程序性坏死下垂的重要调节因子。因此,我们检测了RIP1和RIP3蛋白在Mdr2−/−肝脏中的表达。与WT肝相比,Mdr2−/−中RIP3蛋白的低表达,而RIP1的表达略有上调。这些结果提示Mdr2−/−小鼠的肝损伤可能是由细胞凋亡介导的。接下来研究caspase-8在Mdr2−/−肝脏中被强烈激活后它,在疾病进展中的作用。我们将Mdr2−/−小鼠与Casp8∆HepA小鼠杂交,获得Mdr2−/−/Casp8∆HepA动物。与雄性Mdr2−/−小鼠相比,Mdr2−/−/Casp8∆−/−小鼠在12周和26周龄时的转氨酶水平没有显著差异。这些结果表明,肝细胞中的caspase-8在Mdr2−/−肝脏的疾病进展过程中是必不可少的,尽管它有很强的激活作用。

图1 MDR2缺乏会导致淤胆性肝损伤,并引发细胞凋亡

(A)8周龄和52周龄Mdr2−/−小鼠和WT小鼠的血清ALT和AP水平(n=12-15)。(B)测定8周龄Mdr2−/−小鼠和WT小鼠的血清胆汁酸浓度(n=6)。(C)经H&E染色后的代表性肝脏切片。(D)用Western blot方法检测8周龄Mdr2−/−和WT小鼠肝脏中cleaved-caspase3和cleaved-caspase8的蛋白水平。(E)caspase3和caspase8蛋白水平定量(n=3~6)。(F)对Mdr2−/−和WT小鼠8周龄和52周龄的肝脏进行cleaved-caspase3免疫组织化学染色。红色箭头表示激活了caspase-3的细胞。(G)测定各组小鼠各时间点cleaced-caspase-3活化的细胞数(n=6~8)。(H)用免疫印迹法检测Mdr2−/−和WT小鼠8周龄和52周龄肝脏中RIP1和RIP3的蛋白水平。(I)测定Mdr2−/−/Casp8f/f和Mdr2−/−/Casp8∆HepA小鼠12周龄和26周龄血清ALT水平。Western blot分析采用GAPDH作为载量对照。

NLRP3炎症小体在PSCMdr2−/−肝脏中被激活

炎症小体是激活caspase-1的细胞内信号平台,炎症小体NLRP3与多种肝病有关。为了研究NLRP3与PSC的相关性,对PSC患者和健康对照组的人肝切片进行NLRP3染色。结果发现,PSC患者的IHC显著升高,IL-1β阳性细胞提示炎症小体激活。8周龄和52周龄Mdr2−/−小鼠肝免疫组化显示NLRP3阳性细胞明显增多。此外,在肝组织中发现了NLRP3、pro-IL-1β和IL-1β的蛋白过表达,这与这些肝脏样本中NLRP3、IL-1β、Asc、Caspase-1和Caspase-11的基因表达水平较高一致。这些结果表明Mdr2−/−小鼠的胆汁淤积性肝损伤是由显著的炎性小体激活介导的。

图2  NLRP3炎症小体在PSC和Mdr2−/−肝脏中被激活

(A)与正常对照组(n=5)相比,11例原发性肝癌患者的肝脏门静脉周围有较多的NLRP3和IL-1β阳性细胞。(B)由委员会认证的肝脏病理学家进行免疫组化染色的NLRP3和IL-1β强度评分。(C)石蜡切片上有代表性的NLRP3免疫组化染色。红色箭头表示NLRP3阳性细胞。(D)对各组小鼠各时间点的NLRP3阳性细胞进行定量分析。(E和F)免疫印迹法检测NLRP3、pro-IL-1β和IL-1β蛋白水平和蛋白定量。以GAPDH作为载药对照。(G)RT-PCR法检测肝组织中NlLRP3、IL-1β、Asc、Caspase-1和Caspase-11的mRNA表达。

3  Mdr2−/−小鼠的肠道微生物菌群组成发生了变化

在Mdr2−/−小鼠中,我们发现血清胆汁酸成分发生变化。由于胆汁酸代谢的改变可能会影响肠肝循环,从而改变微生物区系组成,因此我们研究Mdr2−/−小鼠是否表现出肠道生物失调。NMDS分析显示52周龄的Mdr2−/−和WT鼠的盲肠内容物有明显的分离。基于ADONIS粉刺,CAGE的微生物区系总变异性高达34%。与WT小鼠相比,Mdr2−/−小鼠的微生物物种多样性降低。LEfSe分析显示,Lachnospiraceae科在WT和Mdr2−/−之间存在明显差异。有趣的是,Lachnospiraceae与人PSC有关联,其特征是产生异胆汁酸,这表明观察到的胆汁酸成分的变化可能影响微生物胆汁酸的代谢。这些数据表明Mdr2−/−小鼠的慢性肠道疾病导致肠道微生物区系组成显著改变,并导致特定的微生物区系特征。

图3 Mdr2−/−小鼠的肠道微生物区系组成发生了变化

(A)基Bray-Curtis差异的NMDS图谱显示Mdr2−/−和WT小鼠明显分离。(B)基于Adonis的条形图,显示了由“genotype”、“litter”和“cage”因素的肠道微生物区系的变异性百分比。(C)Mdr2−/−和WT小鼠的微生物区系α多样性表现物种丰富。(D)LEFSE分析确定乳螺旋科分类群在Mdr2−/−(红色)和WT(蓝色)小鼠中存在差异调节。

4   Mdr2−/−缺失导致肠屏障破坏

 由于Mdr2基因缺失导致肠屏障功能紊乱,肠道菌群失调可能导致肠屏障功能改变。因此,我们对肠道上皮进行了研究。上皮紧密连接维持肠屏障,其中ZO-1是一种支架蛋白,在紧密连接的形成中起着关键作用。 Mdr2−/−小鼠结肠和回肠ZO-1蛋白和基因表达在不同时间点均明显降低。免疫染色进一步证实ZO-1在 Mdr2−/−小鼠肠绒毛上皮中表达下调。此外,在 Mdr2−/−小鼠的结肠中,小鼠粘液层完整性受到干扰,与WT小鼠相比,粘液明显变薄。为了研究紧密连接表达和粘液层的减少是否转化为通透性的增加,我们用FITC-葡聚糖灌胃 Mdr2−/−和WT小鼠。WT小鼠在给药4小时后血清FITC-葡聚糖水平非常低,而Mdr2−/−小鼠血清中FITC-葡聚糖浓度显著升高。通过测定门静脉血中脂多糖(LPS)浓度进一步证实通透性增加。并且,Mdr2−/−小鼠的肝脏中总细菌和肠杆菌科的基因的相对丰度显著高于WT小鼠。此外,在52周的时间点,所有Mdr2−/−肝中都能检测到肠球菌rRNA基因,而在所有WT对照组小鼠中都检测不到肠球菌基因。因此,这些数据显示Mdr2−/−小鼠的屏障功能受损。

图4  Mdr2缺失导致肠屏障破坏

8周龄和52周龄Mdr2−/−和WT小鼠的结肠和回肠被纳入分析(A-D)。

(A)用Western blot分析结肠和回肠组织标本中ZO-1蛋白的表达。以GAPDH作为载药对照。(2)采用qRT-PCR方法检测ZO-1在结肠和回肠组织中的基因表达水平。(C)冷冻结肠和回肠切片进行代表性ZO-1免疫荧光染色。(D)结肠切片的MUC2免疫荧光染色。(E)测定8周龄Mdr2−/−和WT小鼠肠道对FITC-葡聚糖的通透性。(F)测定8周龄Mdr2−/−和WT小鼠门静脉内毒素浓度。(G)提取肝组织DNA,用qPCR方法测定细菌总数、肠杆菌科和肠球菌细菌16S核糖体RNA基因的相对丰度。

Mdr2缺失会激活肠道中的炎症体信号

由于Mdr2−/−肝脏中炎性小体的激活增加,下一步研究NLRP3的激活是否也参与肠道表型的介导。与WT小鼠相比,8周和52周的Mdr2−/−小鼠的结肠和回肠切片中显示出显著更高的NLRP3阳性细胞。与Mdr2−/−小鼠结肠和回肠中较高的NLRP3基因表达一致。此外,在Mdr2−/−小鼠的结肠中发现NLRP3、Pro-IL-1β和IL-1β蛋白表达增加,RT-PCR分析显示Asc和Caspase-1基因明显上调。这些数据表明Mdr2−/−小鼠肠道中NLRP3型炎症小体的激活与肝病的进展有关。

图5.Mdr2−/−小鼠肠道内NLRP3型炎症小体被激活

(A)NLRP3免疫组织化学染色。红色箭头表示NLRP3阳性细胞。(2)采用qRT-PCR方法检测NLRP3在结肠和回肠中的表达。(C)对大鼠结肠进行NLRP3、pro-IL-1β和IL-1β的Western blot分析。(D)采用RTPCR方法检测ASC和caspase-1在结肠和回肠中的基因表达。

6 Mdr2−/−微生物菌群转移可诱导健康WT小鼠肠道菌群失调

因为Mdr2−/−小鼠肠道微生物区系组成的改变与NLRP3炎性小体激活和肠道屏障完整性丧失有关,因此我们进一步研究Mdr2−/−微生物菌群对肠道内环境稳定的影响。为此,将Mdr2−/−或WT对照小鼠,通过粪菌移植转移到健康WT小鼠中,为期1周。结果发现,粪菌移植Mdr2−/−导致受体WT小鼠ALT和AST显著增加,表明肝损伤增加。这种表型是由受体WTFMT(Mdr2−/−)小鼠结肠和肝脏中明显的NLRP3炎性小体激活介导的。并且粪菌移植后抑制WT(FMTMdr2−/−)小鼠体内ZO-1蛋白的表达。有趣的是,移植Mdr2−/−微生物诱导了受体WT小鼠细菌群落结构的显著变化。比较WTFMT(Mdr2−/−)第0天和第7天,DESeq分析的差异基因表达分析显示,共有12个细菌组显著上调,8个细菌组下调。三个不同调控的OTU是Lachnospiraceae的一部分,我们在WTFMT(Mdr2−/−)小鼠中观察到Bacteroidales S24-7组的扩张,这可能具有致菌潜力。相反,在WTFMT(WT)中仅观察到三个组的微小变化,均属于乳杆菌科(Lactobacillus)。这些数据表明,在Mdr2−/−小鼠中观察到的肠道生物失调可通FMT传播,并导致炎症性肝病。

图6.粪菌移植Mdr2−/−菌群可以诱导健康WT小鼠肠道菌群失调

(A)WT和Mdr2−/−小鼠每隔一天灌胃一次,共1周。(B)测定血清ALT、AST水平。(C)小鼠结肠和肝脏中NLRP3、Pro-IL-1β,IL-1β和Caspase-1蛋白的表达。(D和E)ZO-1在正常和菌群移植的WT和Mdr2−/−小鼠中回肠的用蛋白定量。(F)WTFMT(WT)和WTFMT(Mdr2−/−)小鼠灌胃FITC-葡聚糖4小时后测定血清FITC-葡聚糖浓度。(G)显示肝脏中MoMFs(定义为Ly6G-、CD11bhi、F4/80+)相对丰富的流式细胞仪数据。(H和I))DESEQ分析比较WTFMT(Mdr2−/−)和)WTFMT(WT)小鼠在第一次转移前(第0天)到转移后(第7天)的微生物菌群结构变化。

7 Pan-caspase抑制剂IDN-7314治疗可改善Mdr2−/−小鼠的肝损伤

在Mdr2−/−肝脏中,我们发现不同的caspase蛋白酶被激活,虽然肝细胞中caspase-8的缺失不能改变表型,但我们发现caspase-1和NLRP3被强烈的激活。因此,我们选用用Pan-caspase的抑制剂IDN-7314,在Mdr2−/−小鼠中用IDN-7314治疗后血清参数显示,肝损伤显著减轻。此外,H&E染色显示,与阳性对照相比,IDN-7314处理的Mdr2−/−肝的门脉周围炎症减轻,胆管增生降低。这些变化与Mdr2−/−小鼠经IDN-7314治疗后血清胆汁酸浓度显著降低有关。为了检测IDN-7314对caspase的抑制作用,接着研究了caspase-8的活性。免疫组化染色和免疫印迹分析显示,IDN-7314处理后Mdr2−/−肝组织中caspase-8的表达明显降低。并且,经IDN-7314处理后,Mdr2−/−肝中Cleaved-caspase-3蛋白表达和caspase-3酶活性显著降低。

图7 IDN-7314治疗可改善Mdr2−/−小鼠的肝损伤

(A)通过血清生化指标(AST、ALT、AP、GLDH)测定肝损伤程度。(B)H&E染色的肝脏石蜡切片。(C)测定血清总胆汁酸、β-MCA、DCA和牛磺酸TbMCA浓度。(D)肝石蜡切片上Cleaved-caspase-8免疫组织化学染色和定量。(E)通过Western blot分析IDN-7314和阳性对照处理的Mdr2−/−和WT肝组织中Cleaved-caspase-8、Cleaved-caspase-3的蛋白水平。(F)对WT和Mdr2−/−小鼠肝脏中Caspase-3酶活性进行了分析,比较了Idn-7314处理前后小鼠肝脏中Caspase-3酶活性的变化。

8.IDN-7314治疗重塑Mdr2−/−肝脏微生物菌群并抑制炎性小体激活

使用IDN-7314处理后,结果发现显著改变Mdr2−/−肝脏的微生物菌群,抑制炎症小体的激活,降低血清胆汁酸浓度。接下来,我们分析了IDN-7314治疗对分离52周大的Mdr2−/−和WT小鼠的细菌的影响。乳旋菌科(Otu2)最初在Mdr2−/−中过度膨胀,与WT相比经IDN-7314处理后显著减少。这些结果表明抑制caspase可以重塑在Mdr2−/−小鼠中发现微生物菌群失调来调节肠道-肝脏串扰。并且,通过ZO-1蛋白印迹显示,通过抑制caspase可改善Mdr2−/−小鼠的肠道屏障完整性。由于肠道生物失调可导致肝脏炎性小体激活,我们的研究结果显示,在Mdr2−/−小鼠中,随着疾病的进展,炎性小体表达增强,因此我们研究了IDN-7314治疗对炎性小体激活的影响。Western blot分析显示,IDN-7314治疗后Mdr2−/−小鼠结肠和肝脏中NLRP3、Pro-IL-1β、IL-1β和Caspase-1的蛋白地表达,并且IDN-7314给药后,于对照组相比NLRP3、Asc、IL-1β和Caspase-1、F4/80、IL-6的基因表达水平明显降低。综上所述,这些结果表明caspase的激活显著促进了Mdr2−/−小鼠的疾病进展,并提示NLRP3型炎症小体的激活在这一过程中起着重要作用。

图8 IDN-7314治疗可抑制Mdr2−/−小鼠的炎性小体激活

(A)IDN-7314处理Mdr2−/−小鼠后,与安慰剂处理相比,沙棘科小鼠的OTU_2显著降低。(B)基于Bray-Curtis相异度的主坐标分析图显示,在使用和不使用IDN-7314处理的情况下,Mdr2−/−产仔小鼠是分开的。R中的椭圆是在0.95置信水平下使用多元t分布计算的。(C和D)Western blot分析和量检测IDN-7314或安慰剂处理组小鼠结肠中ZO-1蛋白的表达。(E和F)用Western blot分析IDN7314和载体处理的Mdr2−/−、WT肝和结肠的NLRP3、Pro-IL-1β、IL-1β和Caspase-1的表达。以GAPDH作为载药对照。(G)RT-PCR检测肝组织中NLRP3、IL-1β、Asc、Caspase-1、F4/80和IL-6mRNA在IDN7314、Mdr2−/−和WT肝组织中的表达。

讨论

Mdr2−/−小鼠被认为可以模拟PSC的动物。在这个模型中,磷脂转运蛋白Mdr2,也被称为abcb4的丢失,触发了胆汁淤积反应,导致以胆汁纤维化为特征的肝内硬化性胆管炎。在这里,我们调查了导致肝脏炎症和损伤的途径,以确定新的分子靶点,这可能也与人PSC相关。大约80%的PSC患者患有IBD(尤其是溃疡性结肠炎,但也有克罗恩病),高达8%的IBD患者也患有PSC。有趣的是,IBD和PSC患者往往有更多的进展性肝病。相反,由于PSC而接受肝移植的患者通常患有更严重的IBD。虽然阳性的家族史和男性性别是PSC的公认风险因素,越来越多的证据表明肠道微生物菌群在疾病发病中的作用。在PSC中,几项研究表明,与健康对照组相比,肠道α多样性降低,总体微生物菌群组成发生显著变化。微生物菌群在肠肝轴中的生物学相关性和致病作用尚不完全清楚。

在本研究中,我们首次显示Mdr2−/−小鼠的肠道微生物菌群与WT仔鼠的肠道微生物区系有显著差异。Mdr2−/−微生物菌群表现出物种多样性降低和显著变化的特点,具有通过7α-脱羟基化形成次生胆汁酸的重要能力。同样,PSC患者表现出肠道生态失调,与潜在的慢性IBD无关。在目前的研究中Mdr2−/−小鼠中的38例肠道生物失调与粘液层改变、紧密连接蛋白表达减少和细菌易位增加有关。这些数据表明,Mdr2−/−小鼠胆汁酸组成和流量的变化显著影响肠道,损害肠道屏障的完整性。为了描述Mdr2−/−小鼠肠道生物失调的机制,我们对肠道免疫细胞进行了分析。白细胞保护免受感染,控制宿主-微生物群的相互作用,并保持屏障的完整性。F4/80+肠道驻留巨噬细胞位于肠道固有层,具有重要的作用。Mdr2−/−小鼠的上皮屏障被破坏后出现明显的巨噬细胞浸润,表现出NLRP3的高表达。NLRP3炎症体是一个多蛋白复合体,它协调对感染和细胞损伤的先天免疫反应,是宿主-微生物界面的重要传感器。在激活时,炎症体复合体将Pro-IL-1β裂解成其活性形式,从而发挥促炎功能。事实上,在诱导炎症体相关基因表达的同时,对回肠和肠壁的蛋白质印迹分析也显示了炎症体相关基因的表达。另外,我们目前的数据显示,在Mdr2−/−小鼠中,NLRP3炎症体的激活增加。在这里,活化的IL-1β的蛋白水平升高与肠屏障完整性的破坏有关。
细菌菌群可以诱导NLRP3炎症体的激活,但胆汁酸也可以激活NLRP3的炎症小体活性。表明胆汁酸是多效性的信号分子,其活性远远超过其作为饮食脂质清洗剂的功能。重要的是,胆汁酸是宿主代谢和炎症之间的媒介,在肠-肝循环中连接肠道和肝脏。最近的数据表明,在Mdr2−/−小鼠中也发现初级胆酸CDCA强烈增加。不同的胆汁酸种类可能会对NLRP3介导的免疫反应产生相反的影响,这取决于它们的作用目标。相反,肠道微生物菌群的变化会影响胆汁酸代谢,从而影响胆汁酸介导的生物活性。在我们目前的研究中,我们无法剖析肠道NLRP3活性增加是胆酸含量变化介导的,还是Mdr2−/−小鼠肠道微生物菌群改变的结果。然而,我们清楚地证明NLRP3激活是观察到的表型的一个重要特征。因此,通过抑制NLRP3活性,IDN-7314部分逆转了Mdr2−/−小鼠微生物菌群的变化,并改善了肠道屏障的完整性。
近年来,肠道与肝脏(又称肠肝轴)在健康和疾病过程中的相互作用日益受到重视,并成为一个热门的研究领域。肠屏障完整性的丧失和微生物菌群的紊乱,也在Mdr2−/−小鼠中观察到,加重从非酒精性脂肪肝、ALD到肝纤维化的慢性肝病以及肝细胞癌。在我们的研究中,肠通透性增加导致细菌移位,Mdr2−/−小鼠门静脉内的脂多糖水平和肝脏内细菌DNA水平都有所增加。Maroni等人的最新数据表明,NLRP3炎性小体在人PSC和小鼠DDC模型的胆管细胞中表达增加。在早先的一项研究中,Jahnel等人研究肠道炎症对肝脏的影响,使用葡聚糖硫酸钠治疗慢性结肠炎在其他健康的杂合MDR2小鼠中引发了轻度的门静脉炎症。结果表明,肠道菌群失调导致Mdr2−/−小鼠发生肝病。为了最终证明Mdr2−/−小鼠的肠道生态失调单独触发了肝病的进展,我们进行了FMT实验。移植了Mdr2−/−小鼠菌群的健康WT小鼠部分重现Mdr2−/−小鼠明显的肠道生物失调,表现为炎性巨噬细胞浸润。肝功能和肝功能增强试验(LFT)。此外,我们的数据还首次显示,Mdr2−/−−小鼠的CLD可引起微生物菌群的病理性改变和肠道内环境平衡的失调。根据NASH的报道,肠道微生物菌群失调系触发了肝脏的先天免疫反应。这种表型是通过FMT传播的,并促进了肝病的进展。虽然微生物菌群分析证实FMT的影响,但我们仍然不能完全排除观察到的表型也可能是由转移的代谢物驱动的。为了排除这种偏见,微生物菌群必须在转移前进行体外培养,并从肠道代谢物中分离出来。
在NASH的背景下,使用广谱抗生素影响微生物群可以改善肝脏疾病,并保护无菌小鼠免受饮食诱导的肥胖。来自Tabibian等人的数据表明,无菌Mdr2−/−小鼠实际上发展为更严重的肝病,这可能支持CLD细菌中肠道微生物群的保护功能。值得注意的是,尽管胆汁酸池大了2.5倍,无菌小鼠并没有表现出易患CLD的倾向。因此,这些数据证明了微生物菌群在Mdr2−/−模型中的不同作用。在Mdr2−/−小鼠中,伴随着Mdr2−/−小鼠肠道和肝脏中caspase-8和caspase-1等不同caspase的激活和MAMPs的移位。为了剖析Caspases在该模型中的致病作用,我们引入Casp8∆HepA小鼠,并用泛型Caspase抑制剂IDN-7314药物阻断Caspase的激活。在使用的治疗剂量下,泛caspase抑制剂IDN-7314主要阻断caspase-1和caspase-8。肝细胞特异性抑制caspase-8不能减轻Mdr2−/−小鼠的肝损伤,但IDN-7314通过抑制caspase-1和炎性小体的激活来阻止疾病进展,减轻肝损伤。因此,这些数据表明,在Mdr2−/−模型中,肠道和肝脏中NLRP3的激活使肝损伤持续存在,从而促进了MDR2运输系统中原发性遗传缺陷以外的疾病进展。
综上所述,我们的结果表明肠道菌群失调是Mdr2−/−小鼠慢性阻塞性肺疾病的重要驱动因素。我们的数据指出了胆汁淤积引起的肠道生物失调在肝病进展中的直接致病作用。在这里,NLRP3炎症体是肠肝轴的核心介质。肠道微生物区系和NLRP3炎症小体代表了CLD的有趣治疗靶点,这可能也与人类相关。


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