Nature子刊 | 罗氏弧菌和饮食相互作用调控小鼠动脉粥样硬化
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导 读
患有代谢和炎症疾病的人通常会伴随着肠道内部产丁酸盐细菌的减少，但尚不清楚这些细菌水平的变化是否与疾病发生存在因果关系，以及饮食是否会通过调控这些细菌水平从而对健康产生影响。在本研究中，我们揭示了肠道内的主要丁酸盐产生菌罗氏弧菌（Roseburia intestinalis）的水平与模型小鼠动脉粥样硬化的发生呈负相关。我们将产丁酸盐能力不同的菌群移植到无菌且载脂蛋白E缺陷小鼠体内，证明了罗氏弧菌与HPP相互作用是通过影响肠道中的基因表达，指导新陈代谢从糖酵解转向脂肪酸利用；降低全身炎症；从而改善动脉粥样硬化。此外，小鼠饮食中补充丁酸盐能显著减少内毒素血症和动脉粥样硬化的发展，明确了丁酸在介导动脉粥样硬化病变中的作用。总之，我们的结果阐明了肠道微生物如何通过调控饮食影响心血管疾病，并表明通过提高丁酸盐产生菌的水平可提供针对动脉粥样硬化疾病的保护作用。
论文ID
原名：Interactions between Roseburia intestinalisand diet modulate atherogenesis in a murine model
译名：罗氏弧菌和饮食相互作用调控小鼠动脉粥样硬化
期刊：Nature Microbiology
IF：14.174
发表时间：2018.12
通讯作者：Federico E.Rey
作者单位：威斯康星大学麦迪逊分校
试验设计
通过调控人载脂蛋白E3-Leiden和人胆固醇酯转移蛋白的基因表达，得到动脉粥样硬化的模型小鼠，分析这些小鼠肠道微生物的组成，找到与动脉粥样硬化负相关的肠道菌群——罗氏弧菌，该菌株是典型的丁酸盐产生菌。通过菌群移植的方法将小鼠分为两组（core、core+Ri），比较两组小鼠在HPP饮食下的动脉粥样硬化病变情况，分析二者在肠道细胞表观遗传、转录和代谢上的差异，以及炎症关键因子的表达情况，确证了罗氏弧菌的作用，并明确罗氏弧菌抑制动脉粥样硬化病变的关键物质——丁酸。
试验结果
1 罗氏弧菌的丰度与小鼠动脉粥样硬化病变大小呈负相关
通过调控人载脂蛋白E3-Leiden和人胆固醇酯转移蛋白的基因表达使342只表达这两种基因的F1小鼠在16周的高脂胆固醇饮食中表现出不同的动脉粥样硬化病变，对这些小鼠粪便中的菌群进行16SrRNA基因测序，并进行相关分析以确定与动脉粥样硬化斑块形成相关的分类群。结果显示，罗氏弧菌表现出最强的负相关（图1），提示丁酸盐产生菌可能抑制动脉粥样硬化的发展。虽然血浆总胆固醇水平与动脉粥样硬化呈正相关，但是罗氏弧菌的丰度水平与总胆固醇含量无关，因此推测产丁酸盐的细菌不会影响胆固醇的体内平衡。
图1 菌群与动脉粥样硬化病变相关性
2 罗氏弧菌的定植能调节高植物多糖（HPP）饮食小鼠盲肠中丁酸盐的积累
用从人肠道分离的特定微生物接种的GF小鼠来研究丁酸盐产生菌在体内的作用。将小鼠分为两组，一组是接种人体内常见八种肠内菌，其产丁酸盐能力有限（Anaerotruncus colihominis, Bacteroides caccae, Bacteroides thetaiotaomicron, Clostridium symbiosum, Collinsella aerofaciens, Coprococcus comes, Providencia
stuartii and Ruminococcus torques），标号为core组，另一组是常见八种肠内菌加罗氏弧菌，标号为core+Ri组（图2a）。两组小鼠都喂食HPP饲料，对小鼠菌群丰度测序结果显示，core+Ri组只增加了25.1%罗氏弧菌，而其他菌丰度基本不受影响（图2b）。饲养18周后，处死小鼠，收集血浆和盲肠内容物，测SCFA含量，结果显示盲肠中core+Ri组的丁酸约为core组的四倍（图2c），但血浆中两组的丁酸含量较少，表示丁酸极易被代谢（图2d）。这些结果表明，肠道微生物组成影响盲肠SCFA水平，且罗氏弧菌的定植能增加HPP饮食小鼠盲肠中丁酸盐浓度。
图2 罗氏弧菌与丁酸盐积累相关 a 动物分组和饮食 b 二组小鼠菌群比较 c 二组小鼠盲肠内丁酸盐含量比较 d 二组小鼠血浆内丁酸盐含量比较
3 罗氏弧菌的定植能抑制HPP饮食小鼠动脉粥样硬化斑块的长成
动脉粥样硬化评估结果显示，core+Ri组小鼠比core组动脉粥样硬化的病变比例低30%（图3e），且盲肠中丁酸水平与病变大小呈显著负相关，血浆胆固醇水平与病变大小无关。此外，病理切片和免疫组化研究结果显示，core+Ri组表现出较低数量的巨噬细胞，增加胶原蛋白水平，说明罗氏弧菌的定植促进了动脉粥样硬化斑块的稳定性，但是主动脉窦中的平滑肌细胞水平则没有受罗氏弧菌的影响，由此进一步测定了动脉粥样硬化的炎症标志物，结果显示：Il -6, Il-1β, Mcp1和Icam1均无明显变化，但是TNF-α、Vcam1显著减少（图3j），这二者在控制炎症过程和动脉粥样硬化的发展中起着中心作用。这些实验结果显示罗氏弧菌的定植是极有可能是通过减少炎症的发生来调节动脉粥样硬化。
为进一步验证罗氏弧菌的抑制作用是否与HPP饮食有关，采用同样的小鼠移植core组、core+Ri组菌群后喂食低植物多糖饮食（LPP），结果显示，二组小鼠在动脉粥样硬化病变率上没有显著差别，提示罗氏弧菌对动脉粥样硬化的调节作用是与HPP饮食密切关联的。
图3 二组小鼠各项病变指标比较
4 罗氏弧菌对HPP饮食小鼠结肠表观遗传的调节作用
如上所述，罗氏弧菌的定植能显著提高HPP饮食小鼠盲肠内丁酸盐的含量，而对血浆中的丁酸含量没有影响，因此，可假设罗氏弧菌对动脉粥样硬化的调节能是由肠道内部的变化所介导的。为了评估罗氏弧菌的存在是否影响了喂食两种饮食的小鼠结肠或主动脉中的表观遗传，在近端结肠和主动脉样本中调查了> 50种独特的和组合的乙酰化和甲基化组蛋白PTM状态，染色质特征的主成分分析表明，与喂食LPP饮食的动物相比，喂养HPP饮食的小鼠中的罗氏弧菌对表观遗传表达具有更显着的影响。尽管组蛋白H4未观察到变化，但组蛋白H3的乙酰化和甲基化以及通常在活性转录区域中发现的变体组蛋白H3.3均受罗氏弧菌影响（图4a-e）。在喂食HPP饮食的小鼠中由罗氏弧菌诱导的大多数染色质状态变化指示活跃的转录，这包括组蛋白H3和H3.3上高度甲基化形式的Lys 36和含有K18ac / K23ac的共洗脱同量异位肽的丰度增加，所有这些都与转录和转录延伸的激活有关（图4b-d）。这些增加伴随着含有单甲基化和未修饰的Lys36的肽的显着减少，表明整体向更高甲基化形式的Lys36转变。此外，H3K4和H3K79的甲基化也与转录激活有关。罗氏弧菌诱导K4me1和K79me1的增加，但是喂食HPP饮食的小鼠的近端结肠中K4me3和K79me2减少（图4a，e）。出乎意料的是，在喂食LPP饮食的小鼠中，响应于肠道内分泌物的K4me3显着增加（图4a）。这些数据表明在罗氏弧菌的介导下，饮食和微生物间的相互作用可调节肠道中组蛋白的甲基化和乙酰化，说明这种产丁酸盐的菌株的存在可能通过影响远端肠道中的基因表达而改变对动脉粥样硬化的易感性。
图4 二组小鼠表观遗传因子表达水平比较
5 罗氏弧菌对HPP饮食小鼠能量代谢和降低内毒素血症的影响
为了评估罗氏弧菌是否影响结肠染色质状态变化从而影响基因表达，我们对HPP喂养的小鼠的结肠组织进行了RNA-seq分析。在这两者之间共有101个基因差异表达，具体而言，core+Ri组与脂肪酸氧化相关的基因表达较core组显着增加，如Acox1（酰基辅酶A氧化酶1），Acsf2（酰基辅酶A合成酶家族成员2）和Decr2（2,4-二烯酰辅酶A还原酶2） ，过氧化物酶体。这些结果表明了罗氏弧菌能从葡萄糖中转化生成肠细胞能量底物丁酸盐，丁酸盐调节结肠细胞的能量代谢。
研究表明，丁酸参与肠上皮细胞的代谢作用是通过增强屏障功能降低肠道通透性实现的，因此用FITC法研究了罗氏弧菌体外对肠道通透性的影响，结果发现罗氏弧菌能降低肠道通透性，但是不存在统计学差异（P=0.091）,却能显著降低血浆内的LPS水平（图5cd）。同时，实验还检测了T细胞分化因子水平和炎症相关因子的表达水平，结果二组小鼠间均没有统计学差异。
为进一步明确罗氏弧菌是否能影响体内循环代谢，利用LC-MS分析了二组小鼠血浆，共检测到678种代谢物，其中88种存在组间差异，差异代表的代谢物的富集分析表明，长链脂肪酸（LCFA），磷脂酰乙醇胺，类二十烷酸和支链氨基酸代谢是最受调节的途径之一，所有14种检测到的LCFA的水平在core+Ri组小鼠中较低，其中9种显着减少，表明丁酸盐上调肝组织中脂肪酸的氧化，或者，core+Ri组小鼠中LCFA的减少可能是由于脂肪分解减少，但丁酸盐可以抑制脂肪分解。
图5 二组小鼠代谢相关因子表达比较
6 补充丁酸盐能减少动脉粥样硬化斑块的形成
为了验证丁酸是否能调节HPP饮食小鼠的动脉粥样硬化，将tributyrin（TB，一种丁酸衍生物）添加到饮食中，结果显示，TB的添加不会对菌群丰度有太大的影响，同时对肠内容物和血浆中的其他SCFA含量基本无影响，但是能显著抑制动脉粥样硬化斑块的形成6c，e)，脂质沉积(图6c，f)与巨噬细胞积聚（图6d g）。
图6 有无TB补充剂小鼠动脉粥样硬化病变情况比较
讨 论
本研究提供了一个因果证据，证明产生丁酸盐的细菌丰度增加可导致丁酸盐在盲肠中含量的升高；肠道中的表观遗传、转录和代谢发生变化；减少全身炎症、调节动脉粥样硬化病变。其次，证明了罗氏弧菌的定植可降低内毒素血症，可通过改善屏障功能，减少血浆和主动脉中的炎症标志物水平，以及依赖于饮食的方式调节动脉粥样硬化病变程度，最后，明确了罗氏弧菌对动脉粥样硬化的调节主要是由丁酸介导的，通过适当补充丁酸的量可以有效预防动脉粥样硬化的发生。
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