利用Image J测量荧光强度

测量荧光图片的荧光强度，也是一个常用的操作，单荧光图片直接测，多荧光通道merge图片拆分一下通道也很方便。下面就荧光强度测量中常常会遇到的三种情况进行图示：通道整体平均（加和）荧光强度、指定区域平均（加和）荧光强度以及大量细胞单独的平均（加和）荧光强度，本质上其实还是在玩选区。

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测量整体平均荧光强度

1、打开一张荧光图片，并拆分成三个通道图。

2、以蓝色通道图为例，选择Image-Adjust-Threshold，勾选Dark Background，点击Auto，结果将自动识别蓝色的细胞核，并且以默认的红色蒙版表示细胞核选区；

3、选择Analyze-Set Measurements，勾选必须的测量选项：Mean gray value；Area 和Integrated Density可以不勾选，这里勾选；由于是利用threshold产生的红色蒙版来确定测量的选区，所以Limited To Threshold必须勾选，否则是以整个图片作为选区进行测定；由于有多张图片在测量，把Display Label也勾选上，以示区别。

4、选择Analyze-Measure（快捷键Ctrl+M或M），获得结果，结果Mean表示平均灰度值，IntDen表示总的灰度值；这个平均灰度值就可以用来表示图片中的平均蓝色荧光强度了，图片里面的细胞核越多，结果就会越准确。

同样的方法可以测量绿色和红色通道的荧光强度。

5、本教程前四步和之前有关测量的教程里面，其实我们测的都是灰度值，这是软件默认的表示方法。我们可以通过设置，测量真正的光密度值：选择Analyze-Calibrate，选择最下面一个Uncalibrated OD（未校正的OD值），会弹出Uncalibrated OD和pixel value（像素灰阶值）的关系曲线。

我们从第4步获得的结果可知，蓝色通道图片被threshold所选择的细胞核像素灰度值是53-255，在上面这条曲线里面，我们可以看到这个区间的灰阶值和Uncalibrated OD是基本成线性关系的（事实上灰阶值比较低的像素点是黑色的，被当成背景处理了），所以可以用Uncalibrated OD来表示细胞核的平均荧光强度。

6、选择Analyze-Measure（快捷键Ctrl+M或M），获得结果，结果Mean为0.416，这就是平均的Uncalibrated OD，IntDen表示总的Uncalibrated OD；

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少数区域的平均荧光强度

如果不想测量被Threshold所选择的所有区域，比如我就对左下角这个完整的细胞核感兴趣，我只想测量它的平均荧光强度该怎么办呢？

很简单，在用Threshold做出选区之后，使用其他选区工具对自己感兴趣的区域进行再次选择，然后测量就可以了。比如下图，使用矩形工具在图片上面拉一个框：

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大量细胞各自的平均荧光强度

如果图片中有多个荧光对象，我想测量每一个对象的平均荧光强度怎么办呢？很简单，把每一个需要测量的对象都建立选区，然后分别对每个选区进行测量即可。

1、打开一张图片，选择Image-Type-8 bit（如果是如本教程拆分出来的单通道图片，则不需要再转成8 bit）；

2、选择Image-Adjust-Threshold，勾选Dark Background，点击Auto，利用threshold构建选区，选出需要测量的区域，这里是细胞核。

3、因为有些细胞核连在一起了，需要用到二值化（Binary）里面的“分水岭”（Watershred）法来进行分割，所以这里点击Apply对红色蒙版选区进行二值化；

4、选择Process -> Binary -> Watershed，分割连在一起的细胞核；

5、选择Analyze -> Analyze Particles，务必勾选“Add to Manager”，将这一步产生的选区添加到ROI管理器中。前面到这里的五步和细胞自动计数是一样的，唯一不同的地方就在于此，要勾选Add to Manager！

7、到此，获得了所有细胞核的选区！勾选Show all，选择File-Revert（或者关掉图片重新打开一次），回到荧光照片最初的样子，但是刚刚建立的几百个选区仍然存在；

8、点击ROI管理器上面的Measure，将获得每个选区的测量结果，每个细胞核各自的平均荧光强度就测出来了。当然，在测量之前同样可以转换成Uncalibrated OD；

以上就是常见的荧光强度测量方式，有没有帮到你呢？