收藏贴：Western人人都会做，居然还有这么多门道。
因为这一周去北京除了一趟差，见到了“故都的秋”，也见到了一个39岁的杰青，很是漂亮，第一次知道人的眼睛中冒星星是怎么样子。和她谈话后被深深的折服，希望以后可以从她那里学习到更多的东西。
先放一张北京的银杏树图片给大家看看。
在上周讲了用尿素提取蛋白的方法，收到很多同行的回复。
先在此一一说明。
首先没有一个方法是百分之百好的，它肯定也有缺点。尿素提取蛋白的缺点呢也是有很多的。
首先尿素的分子式是CH4N2O，首次是由氰酸钾与硫酸铵人工合成。
尿素的总反应式是2NH3+CO2→ CO（NH2）2+H2O。
表达在该公式的生产反应总体上为一个可逆的放热反应。所以尿素加热会容易造成分解，并也会造成蛋白甲酰化。
故在第一篇讲不同蛋白提取液时，有讲到说尿素提取液适用于不做任何蛋白修饰，只看蛋白变化量的WB。
做每一个事情都有个标准，在这个标准之内叫相安无事，在这个标准之外叫碰碰运气。
在第二篇中有讲到，蛋白提取要长期保存的可以使用盐酸胍之类的。
很多人使用尿素和盐酸胍时是在提取包涵体时使用。
有见到做质谱分析的老师用低浓度的2M尿素、硫脲、SDS、蛋白酶抑制剂作为蛋白裂解液的，在这其中，尿素又是另外的作用，这时的尿素能够断裂蛋白氢键，使蛋白发生不同程度的变性，同时增大疏水氨基酸残基在水相中的溶解度。
好了，希望大家可以多多提问题，我们一起讨论，一起进步。
今天开始进入WB的探讨。
WB的使用基于抗体的检测靶蛋白在细胞或组织提取物中的表达。其使用的抗体可以是特定的总蛋白或独特的蛋白质的翻译后修饰，如磷酸化，乙酰化，甲基化，泛素化等。
特异的抗体可以帮助我们检测到特异的信号通路分子的表达。
在实验开始之前，应该明确自己需要检测的靶蛋白是哪些，我需要进行怎样的干预，蛋白标本应该怎么收取等等，也就是你应该有自己的一套解决方案。
一、配液
1.配置1.5M pH8.8 Tris-HCl, 1M pH 6.8 Tris-HCl
2. 5X Running Buffer
3. 10X Transfer Buffer
4. 10XTBS
配胶
分离胶（2块量）
注：在加入TEMED之前混匀液体，尽量不要出现气泡。加入TEMED后充分混匀，迅速倒入玻璃板中，用600ul无水乙醇或异丙醇压板。
浓缩胶（2块量）
二、上样前准备
1. 蛋白定量
一般有三种方法：Bradford法Lowry 法或BCA法（操作简单、需分光光度计或酶标仪），小牛血清白蛋白(BSA) 可做标准曲线的稀释样品。如果裂解液中有NP40或其它表面活性剂如SDS，一般使用BCA 法。三种方法或产品比较列表如下（注：此表来源于网络）：
2. 样品准备
2.1变性、还原蛋白样本
一般的抗体只能识别抗原表位，因此，需要使蛋白变性暴露抗原表位。蛋白变性一般使用SDS的上样buffer（loadingbuffer），并于95-100°C 煮沸5分钟，对于如G蛋白这种多次跨膜蛋白，可以于70 -80°C 加热 5-10分钟。原理是SDS的阴离子环绕蛋白肽键使之带负电荷，蛋白分子量不同，结合的SDS数量不同，所带负电荷也不同，电泳迁移速度不同，因此SDS-PAGE电泳可将不同分子量的蛋白分离开。
2.2天然和非还原样本
某些自备的抗体或者特别的抗体（说明书会标注），他们识别的抗原表位是非连续氨基酸构成的蛋白三维结构，这时需要进行非变性的WB，此时蛋白样品准备时不需要SDS，样品也无需煮沸。而另外有些抗体只能识别蛋白的非还原态，比如测定半胱氨酸的氧化状态时。此时的loadingbuffer不需要加β-巯基乙醇和 DTT等这些试剂
3．电泳
3.1 PAGE胶的制备（制胶见上面一）
不同分子量的蛋白选择不同的凝胶浓度（参考下表），原则上高分子量蛋白用低浓度胶，低分子量蛋白用高浓度胶分离。
在跑小分子时，果子老师团队很有经验，可以呼唤他专门讲一期。
3.2蛋白分子量Marker
预染或非预染各种分子量的蛋白，用于标示电泳中蛋白的大小和示踪，可根据自己需要选择。
3.3阳性对照
主要用于检测整个实验体系及过程的正确性有效性，特别是抗体的质量和效率。建议使用。可查阅文献或抗体说明书选择购买或选择表达丰度高的细胞提取。
3.4内参对照
一般是管家基因编码的，在很多组织和细胞中都稳定表达的蛋白，用于检测整个实验过程及体系是否正常工作，并作为半定量检测目的蛋白表达量的标准对照。必须设立。
4.上样与电泳
每孔上样量蛋白根据自己需要，建议使用专用枪头，勿溢出加样孔。电泳时间按电流仪说明书使用(2小时或过夜，取决于电压大小），当染料到达胶的底部时可关闭电源，胶不能存放，应立刻进行下一步的转膜。
5. 转膜显色
5.1检测胶中的蛋白
电泳后检测蛋白是否迁移正确与平均，可采用银染或考马斯蓝染色。
考马斯亮蓝染色要分几种，有兴趣的可以去了解。
在这分享个小窍门，一般我们在进行完考染后，会用甲醇加醋酸的溶液脱色，但是这个方法有毒。所以我们课题组常规会用清水洗几次后，装满清水放入微波炉中高火一分钟，重复两次，每次需要置换清水。此时可以看到模糊的条带了，如果需要很快看到结果可以用醋酸及甲醇再脱色10min即可。如果不需要很快看到，可以放入清水中慢慢脱色。
5.2蛋白转膜
蛋白因结合SDS而带电荷，在电场下从胶中转至膜上，转膜操作根椐电转仪制造商的说明书进行转膜方式分为半干和湿转两种，半干式转膜速度快，而湿转成功率高并特别适合用于分子量大于100KD的蛋白。
湿式转膜三明治排列为：海绵/纸/胶/膜/纸/海绵（胶黑膜白），全部紧密排列，不能留有气泡，安放的方向，负极方为带负电的胶里的蛋白，向正极方（膜）电迁移。标准的电转缓冲液为1XTris-glycine buffer 不含SDS，但加入20%甲醇，如果转膜的蛋白分子量大于80KD，则推荐加入SDS使之终浓度为0.1%，并减少甲醇的浓度至10%，最低时可达5%。
半干式转膜中，三明治的排列为：/纸/胶/膜/纸，用电转缓冲液浸湿后，直接置于电转仪的正负极之间。胶于负极而膜置于正极。半干式的电转缓冲液可不同于湿式的电转缓冲液比较特别，推荐为：48mM Tris, 39 mM glycine, 0.04% SDS, 20%甲醇。
转膜时有两类膜可供选择：硝酸纤维素膜和PVDF膜（正电荷尼龙膜），根据不同需要选择（可以网上找寻），PVDF膜需要浸泡甲醇中1-2分钟，再孵育于冰冷的电转液中5分钟，胶也需在冰冷的电转缓冲液中平衡3-5分钟，否则转膜时会导致条带变形。
电转液中的胶的浓度、蛋白分子量的大小、SDS与甲醇的平衡这些都会影响转膜效果，可以作些微调整提高转膜效率：
大分子量蛋白（一般大于100KD）
1．对于大分子量蛋白，其在凝胶电泳分离迁移及从胶转出均较慢，所以需采用低浓度的分离胶如8%。
2.其易在凝胶形成沉淀，故而在转膜时在电转液中加入终浓度为0.1%的SDS，。甲醇易使SDS从蛋白上脱失，因此应降低电转液中甲醇的浓度至10%或更低，以防止蛋白沉淀。
3.降低电转液中甲醇的比例以促进凝胶的膨胀，易于蛋白的转出。
4．如果使用PVDF，甲醇是必需的，且转膜前PVDF需用甲醇活化。但如果是NC膜，甲醇可以不必加入电转移缓冲液中。
5．选择湿转，低电压或低电流4 ℃转膜过夜。
小分子量蛋白（小于100KD，其实60-100kD大小的蛋白也可以用大分子量蛋白方法）
1. SDS妨碍蛋白与膜的结合，特别是对小蛋白更是如此，因此，对于小分子的蛋白，电转移缓冲液中可以不加SDS。
2.保持20%的甲醇浓度
对于大于300KD的蛋白，可以选择themofisher的专门针对于大分子蛋白的WB的盒子。
更多的转膜注意事项：
避免直接接触膜，应使用镊子，因为手指上的油脂与蛋白会封闭转膜效率并易产生背景污斑，但是如果您的手指够细，又带了新手套，也可以用手。我喜欢用手操作，嘿嘿。
转膜时可以用切胶板赶除胶与膜之间的气泡
确认裁剪的膜和滤纸与凝胶尺寸相同，否刚导致电流不能通过膜，从而转膜无效
告诉大家一个小知识，鸡来源的抗体易于与PVDF膜和其它尼龙膜结合，导致背景高，可用硝酸纤维素膜以降低背景。
膜上蛋白的检测：丽春红。为检测转膜是否成功，可用丽春红染色，此等染液碧云天就很好用，有详细说明书。
6. 膜的封闭
为防止一抗或/和二抗与膜的非特异性结合产生的高背景，因此需要进行膜的封闭，
传统上有两种封闭液：脱脂奶粉或BSA，脱脂奶粉成本低但不能用于磷酸化蛋白（因脱脂奶粉含有酪蛋白，该蛋白本身就是一种磷酸化蛋白），使用脱脂奶粉会结合磷酸化抗体从而易产生高背景。但是在美国的时候，实验室老师用一款Windex买的脱脂牛奶封闭也能用于磷酸化蛋白检测。
某些抗体在使用BSA封闭时因不明原因可能会产生比脱脂奶粉更强的信号，抗体说明书上会有。现在很多公司也有专门的封闭液卖。总之在使用之前，请认真阅读说明书。
配制5%脱脂奶粉或BSA 溶液：每100 mlTBST中加入5g脱脂奶粉或BSA，混匀后过滤，如不过滤会导致使膜污染上细微黑颗粒。
封闭时，4°C摇动，封闭6 hour ，或者室温封闭1 hour。再用TBST洗5秒，进入下一步抗体的孵育。
7. 一抗的孵育
抗体的稀释可用5%或2%BSA，2%的牛奶，专门的抗体稀释液，或者直接用TBST或者PBST。
按抗体说明书建议的稀释倍数，用以上液体稀释一抗，如果说明书没有建议的稀释倍数，则参照一般推荐的稀释倍数(1:100-1:3000)，一抗浓度过高会导致产生非特异性条带。（我一般做WB会选用PBST稀释抗体，而做IFA会选用专门的抗体稀释液稀释）。
某些实验室传统上在封闭液中孵育抗体，而有些实验室用不含封闭剂的TBST来孵育抗体，结果因抗体而异，有时两者结果相同，有时结果不同。
如果不存在高背景的问题，某些抗体用含低浓度(0.5– 0.25%)脱脂奶粉或BSA的封闭液来,稀释，可产生相对更强的信号条带。
孵育时间：一抗的孵育时间可从几小时至过夜（一般不超过18小时）不等，取决于抗体与蛋白的亲和性和蛋白的含量丰度，建议使用较高的抗体稀释倍数和较长的孵育时间来保证特异性结合。
孵育温度：尽可能低温孵育，如果在封闭液中孵育一抗过夜，应在4℃进行否则会产生污染而破坏蛋白（降别是磷酸基团）。孵育一抗时需保持适当的摇动使之均匀覆没膜，防止结合不均匀。
8. 二抗的孵育
一抗孵育结束后，用TBST摇动洗膜数次，每次5min或更长，去除残留的一抗。（你要相信留下来的才是最好的）
抗体稀释液如一抗。
孵育时间和温度：室温、1-2hours, 摇动。
二抗连接物：推荐使用二抗连接HRP，不建议连接AP碱性磷酸酶，因其不够灵敏。
9. 显色
显色分为酶促底物发光和化学发光法或荧光法
Western Blot显色的方法主要有以下几种： i. 放射自显影 ii. 底物化学发光ECL iii. 底物荧光ECF iv. 底物DAB呈色。现常用的有底物化学发光ECL和底物DAB呈色，体同水平和实验条件的是用第一种方法，目前发表文章通常是用底物化学发光ECL。只要买现成的试剂盒就行，操作也比较简单，原理如下（二抗用HRP标记）：反应底物为过氧化物+鲁米诺，如遇到HRP，即发光，可使胶片曝光，就可洗出条带。
第一张是ECL显影，第二张是X光片显影。如果你的蛋白表达丰度不高时，可选择用X光片显影，它的灵敏度与特异度都是非常好的，只是操作会很繁琐。
好了，今天就写到这里，谢谢大家，我们下周见。
预告，明天会有神秘嘉宾登场，带来一篇实验相关的长帖子。