小药说药药物篇-为一个人研发的药物：“Milasen”
PART 01 米拉的不幸
米拉（Mila）出生时是个健康可爱的胖娃娃，有双明亮好奇的大眼睛。据她爸爸说，出生半小时后她就紧紧地拽着爸爸的手指，让爸爸无法挣脱。米拉外向、好动又爱笑，她不到一岁会走路，不到两岁就会说一百多个单词。在家里，在院子里，到处都是她的身影，爬楼梯、抓虫子、给爸爸妈妈搞恶作剧，成功后就咯咯地笑个不停。
米拉非常热爱户外运动。夏天和爸爸一起野营；到了冬天，爸爸妈妈带着她去滑雪。米拉一家住在美国的科罗拉多州，冬天那里是滑雪胜地，米拉两岁时，就和爸妈去了雪场滑雪。
但这美好的一切，都在米拉三岁那年开始悄悄改变。她的父母首先注意到她说话有时会想不起常见的词，而且她的左脚有些往里弯曲。四岁时，米拉的视力逐渐下降，看书时会把书本往鼻尖下凑，仿佛看不清楚。渐渐的，她走路姿势也出现变化，变得踉踉跄跄 ，经常走着走着就摔倒。她的说话能力也在退化，直到她完全忘记了最后一个单词：妈妈。
米拉六岁的一天，她的父亲注意到她在看最喜欢的电影《冰雪奇缘》时，眼睛没有对着屏幕。父亲用手在米拉面前晃着，她却毫无反应。这一刻，他意识到，米拉已经完全失去了视力。
发生在米拉身上的状况，让她的爸爸妈妈心急如焚。在辗转了多个医生和医院后，最后在科罗拉多州的医院，米拉的症状终于有了一个解释：米拉得的是一种溶小体储蓄积症的一种，叫巴顿病（Batten disease），这是一种罕见的、快速进展的神经系统疾病，通常在儿童或青少年时期出现，是一种致命性的疾病。患巴顿病的孩子，大脑和视网膜的细胞受损最为严重，所以出现神经和视觉的问题：退化性的语言困难，走路困难，失明，癫痫，直至无法行走，自主进食等。发病的孩子平均在3岁左右出现症状，寿命在12岁左右时终止。这是令任何家庭都会心碎的结局。
上图是米拉头部的核磁共振成像（A)和皮肤活检(B) 的结果。可以看到，磁共振成像头部显示轻度脑萎缩和小脑萎缩，24小时脑电图脑电图（EEG）也显示了几个亚临床的癫痫发作。皮肤活检显示异常，电子致密，漩涡指纹样的溶小体，这是巴顿病特有的溶小体形态。
巴顿病是一种常染色体隐性遗传的疾病，只有父母双方都具有致病基因，才会遗传给孩子。但在常规的基因测序中，医疗人员只在米拉的基因组里找到了一个在CLN7基因里的突变，这个突变和她父亲携带的一样。但她的另一个基因突变，以及她母亲的基因突变却没法被找到。而想要找到治疗米拉的办法，必须找到另一个致病基因突变。
于是，米拉的母亲朱莉亚成立了一个叫“米拉奇迹基金会”(Mila’s miracle foundation)的公益组织，并在各大社交网站上讲述米拉的故事，寻找可能找出米拉的致病基因的科研团队。很凑巧，朱莉亚的一个医生朋友在社交网站facebook上的“医生妈妈群”里贴出了米拉的故事，而这个故事恰好被另一个医生妈妈，Cindy Lien 看到。Dr.Lien 当晚就把这件事告诉了同是医生的丈夫，Timothy Yu。
Dr.Yu 不仅是一名神经科医生，也是一名专研基因测序和罕见病的医生-科学家。Yu 医生听到这个故事后，想到自己同样年幼的孩子，很受触动，第二天就打电话联系到了朱莉亚。几天后，他收到了朱莉亚寄来的米拉的血液和皮肤样本，开始进行全基因组测序。对测序数据进行仔细检查后发现，在MFSD8内含子6深处有一簇嵌合序列，在米拉和母亲的基因组中均检测有该序列。这簇嵌合序列或者在一端与非定位的poly-T序列融合，或者在另一端与非定位的六聚重复序列（AGAGGG）融合，因此提示存在起于和止于这些基序的DNA插入。嵌合断点偏移了14个bp，提示内源性靶序列有重复。
终于，Yu医生的团队在非编码DNA区域里找到了米拉的第二个突变。米拉和母亲体内均有一个约2 kb的序列插入，RepeatMasker分析证实该序列为SVA反转录转座子。SVA插入可调节附近基因的剪接，RNA测序（RNA-seq）和反转录酶PCR分析显示，在米拉和母亲的血样和淋巴母细胞中，在SVA插入位点上游119 bp处，外显子6错误剪接到MFSD8内含子6内的隐蔽剪接受体位点（i6.SA）内。这一错误剪接正是与SVA插入序列一起分离，导致翻译提前终止，这一观察结果支持插入序列的致病性。
这样，米拉的病因终于找到了。原来米拉的父母都是杂合子携带者，而米拉是SVA插入和c.1102g→c的复合杂合子。一小段变异的DNA编码“跳进”了米拉CLN7基因的非编码区, 导致了米拉CLN7的基因无法正常表达。
找到了致病的原因，Yu医生有了新的想法。他告诉米拉的父母，可能有办法帮助米拉。Nusinersen是FDA批准用于治疗脊髓性肌萎缩的反义寡核苷酸药物（ASO)，该药可改变SMN2 RNA的剪接模式，同样地，反义寡核苷酸可能能够类似地用于米拉，起到纠正错误拼接、恢复MFSD8表达的作用。这不是传统意义上的基因疗法，因为它并不改变米拉本身的基因。而是用一段人工合成的DNA去把搞破坏的那小段DNA隐去。用Yu医生自己的原话：这就像是一种分子“创可贴”，可以使基因正确组装。
于是，Yu医生开始了为米拉设计反义寡核苷酸药物的工作。Yu医生的团队首先设计了靶向作用于i6.SA隐蔽剪接受体位点和附近剪接增强子的反义寡核苷酸。
在成纤维细胞内测试这些反义寡核苷酸时，发现有3种反义寡核苷酸可将正常：突变剪切比值提高至2.5～3倍。其中TY777最有效，因而成为首选的候选反义寡核苷酸。Yu医生把这个特别为米拉设计的药物以米拉命名：叫Milasen。
Milasen是一种包含22个核苷酸的反义寡核苷酸，与nusinersen具有相同的主链和糖化学修饰（硫代磷酸和2'-O-甲氧乙基) 。剂量-反应分析表明其半数最大效价在纳摩尔范围。成纤维细胞的RNA测序表明，milasen治疗使正常（外显子6-外显子7）剪接增加了2倍多。基于计算机的milasen序列分析表明，其在人类基因组中发生脱靶结合的可能性很小。体外试验表明，米拉的成纤维细胞具有溶酶体功能障碍的数种特征性细胞表型，包括细胞内空泡形成、溶酶体总量增多、自体荧光、溶酶体酶活性的错误区室化（miscompartmentalization）以及自噬潮（autophagic flux）减少。milasen使所有上述表型达到缓解，说明这一治疗不仅可以挽救剪接，还可以挽救功能。
然而，设计一段人工的DNA序列，在没有动物模型的情况下（因为不存在这样的动物模型），直接用在一个病人身上治疗疾病，这是史无前例的。如何保证它的安全性，可行性，如何在批量生产中保证质量，如何获得FDA的支持，如何承担所需的昂贵费用，个个都是大难题。所以，Yu医生最后感慨， “科学这部分相对简单，如何完成这个临床试验那可难多了”。
米拉的病情仍在持续恶化，米拉7岁时的临床评估显示，她已经不能说出可辨别的单词，有吞咽困难（为此放置胃造口饲管），需要大力搀扶才能行走，并且每日有15～30次明显癫痫发作。然而，米拉仍然神清并且对熟悉的刺激有反应，听到喜欢的书和歌曲时也很高兴。
Yu医生的团队为了挽救米拉的生命，开始了争分夺秒的药物申报过程。经过适当的科学和伦理审查之后，团队向FDA提交了“扩大使用”试验性新药申请，并申请开始临床试验性治疗。生产并配制了用于临床的milasen原料药（18 g）。为了确定潜在风险，通过鞘内注射的方式将3种剂量的milasen用于大鼠：0.06 mg、0.25 mg和1.0 mg。0.06mg组中未观察到不良反应。在较高剂量下，一些动物出现后肢无力，并且后肢无力在每次给药后约24小时缓解。这些结果提供了潜在毒性作用的衡量指标，这些指标易于监测，并且可指导后续的临床研究方案设计。
动物毒理学研究开始1个月后，对米拉开始了milasen临床研究。治疗方案大致模仿了nusinersen的治疗方案 ，因为这两种药物有相似之处。milasen采用鞘内推注，初始剂量为3.5 mg，大约每2周增加一次，直至42 mg。剂量增加后，再给予两次负荷剂量，之后大约每3个月给予1次维持剂量。米拉终于用上了专门为她而设计的药物。下图记录了这项“单一患者”临床试验的部分结果。图A显示了给药时间表。图B显示了每次给药前脑脊液（CSF）内的milasen浓度（谷浓度）。图C显示了米拉父母在癫痫发作日记中记录的癫痫发作频率和持续时间的趋势。图D显示了脑电图（EEG）检测出的癫痫发作活动的趋势。结果显示每日癫痫发作次数、癫痫发作持续时间和癫痫发作累积时间所占的百分比分别减少了63%（从每日31.5次减少至11.7次）、52%（从108秒缩短至52秒）和85%（从3.9%减少至0.6%）。
重重困难下，让人惊叹的是，从找到第二个基因突变到让米拉用上药物，Yu医生带领的团队只用了不到一年。这里面包含着团队的坚持努力，更有团队所在的波士顿儿童医院（哈佛附属）各个部门，FDA, 负责批量生产的医药公司，其他合作的科研团队，和米拉父母的不懈支持和努力。比如，ASO的设计，药物剂量安全的测定，如何运输到米拉体内（通过脊髓液），医学伦理的测定，都得到了不同领域专家的鼎力相助。
2019年10月9日，这个具有里程碑意义的临床试验的早期结果发表在新英格兰杂志上。文中列出了研发中的关键时间点：
2017年1月：Yu医生团队联系到米拉
2017年2月：确认第二个基因突变
2017年4月：实验用的米拉的细胞系确认
2017年5月：基因剪切位的突变被确认
2017年9月：效果最好的ASO序列被确认
2017年10月：ASO的功能进一步确认
2017年12月：开始小鼠体内的安全性试验
2018年1月：FDA同意开展临床试验
2018年1月：FDA开绿灯后第六天，米拉用上了Milasen，这个专门为她研发的药物
Milasen 给了米拉的人生一个不同的可能。这个药虽然无法治愈她的疾病，但从早期的数据来看已经明显延缓了疾病的进程和她的症状。比如，以前米拉每天会出现癫痫20-30次，用了Milasen之后，它出现癫痫的次数已减少到每天0-10次，癫痫持续时间也大为减少。米拉又可以开始从口进食吞咽，而不是依赖于胃管饲。
在这个案例中，实现milasen迅速开发的原因主要有以下几点：患者病情急迫，反义寡核苷酸药物可通过序列特异性方式进行定制，已经有nusinersen（具有相同的主链、糖和碱基化学成分）安全用于脊髓性肌萎缩患儿的先例，此类药物在CNS中的良好摄取和长半衰期，以及寡核苷酸药物的制造过程相对简单（与小分子或生物制剂相比），因此可以及时进行小批次生产。
milasen本身仍然是一种试验性药物，不适用于其他巴顿病患者，因为设计该药物时，它是根据米拉的特异性突变定制的。然而，这一经验表明，我们可能应该考虑将反义寡核苷酸作为快速提供个体化治疗的平台。当然，对这一方法的进一步探索仍然需要仔细地逐例考虑一些科学、临床和伦理问题。目前，只有在特别严重或危及生命的情况下才能考虑采用这一方法。随着我们对基因和分子生物的进一步认识，基因工程，基因疗法和个体化疗法必是未来的方向。而这个成功的例子让我们看到了这个未来的轮廓。也许，“分子创口贴”+ “基因疗法”是治疗罕见病的可行组合。
当然，问题还有很多，如何支付天价费用， 如何面对无可避免的不好结果，如何评估只有一个病人的疗效好坏，等等。但我相信，只要众多领域团结合作，这些问题都会引刃而解。