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上篇回顾：行研 | 双特异性抗体药物技术概览（上）
链错配问题会降低双抗产量、增加纯化难度，也提高了生产成本，因此，获得正确组装的双抗成为了一个关键问题。在过去几十年中，许多策略被开发出来以提高产物的同质性和目标分子的产率，成为了各种双抗技术平台的基础。这些技术平台有各自独特的双抗分子构建模式（formats），目前的数量已有逾百种，根据它们的设计特征或功能特性，可以分为片段模式和全长模式。表1 | 片段模式和全长模式双抗技术平台一般性特点对比图片来源：Labrijn A. F., Nature Reviews Drug Discovery [J] 2019片段模式的双抗简单地将多个抗体片段结合在一个分子中，且不含Fc区，以此来避免链相关问题。这类双抗的抗体片段结构较多会采用抗原结合片段（Fab）、纳米体（VHH）、单链抗体（scFv）等作为模块串联，将不同特异性的抗体片段按照效价组合成1 1、1 2和2 2的结构，甚至还有1 3、3 3的结构也在研发中。此类双抗不存在复杂的结构，因此生产工艺相对简单、产量高、成本低，并且无Fc片段可使其具有较低的免疫原性，而更小的分子量则赋予了较高的肿瘤组织渗透性。但另一方面，Fc片段的缺失也使它们会失去完整抗体所具有的一些优点。因此，片段模式的双抗会存在半衰期相对较短的缺点，也可能会引起稳定性和聚集的问题。目前已商业化的BiTE、DART、TandAb、Bi-Nanobody等技术平台都是基于片段的模式。BiTE是由Micromet公司（2012年被Amgen收购）开发的一种串联单链抗体技术，由一个结合T细胞抗原（如CD3）的scFv与结合TAA的scFv通过肽段linker连接而成。BiTE双抗可同时结合T细胞和肿瘤细胞，将T细胞募集至肿瘤细胞表面，从而激活T细胞进行肿瘤杀伤。BiTE技术克服了scFv稳定性差、表达量低、溶解性低等生产问题，成功实现了商业化，代表药物为Blinatumomab。DART是由MacroGenics公司和Servier公司联合开发的新一代双抗构建技术。DART双抗是由两条多肽链结合形成的异源二聚体抗体，具有两个独特的抗原结合位点。其结构是将一个抗体可变区的VH和VL序列分别与另一个抗体可变区的VL和VH序列连接形成。此外，在两条多肽链的C末端引入了半胱氨酸，通过半胱氨酸形成链间二硫键，提高了产品的稳定性。与上述通过多肽linker连接的BiTE技术不同，DART的设计可以模仿IgG分子内的自然相互作用，在体外和体内给药都可以保持效力，并且在生产中聚集的规模更低。TandAbs是由Affimed公司开发的四价双抗分子，针对两种抗原各有两个结合位点。其结构为Fv1-Fv2-Fv2-Fv1，是由两条多肽链反向配对形成的同源二聚体分子。TandAbs相对分子量约为105kDa，超过肾清除阈值，与小分子的抗体相比，半衰期可延长至约23h；同时蛋白无糖基化修饰，产品更为均一，免疫原性低。图5 | BiTE、DART、TandAb模式的结构图图片来源：来源：Wang Q., Antibodies [J] 2019Bi-Nanobody由Ablynx公司（2018年被Sanofi收购）开发，是一种单域抗体，来自于骆驼及美洲驼体内的一种缺失轻链的重链抗体的可变区片段VHH。该类产品的主要优点是分子小、稳定性高、易于人源化、易于连接，分子小使其易于穿过较深的组织并靶向一些正常IgG抗体难以到达的表位。不过，缺乏Fc的纳米抗体在体内的循环半衰期较短，可以通过融合人血清白蛋白或白蛋白功能区将半衰期延长至2～3周。全长模式又可进一步分为对称模式和不对称模式。对称模式的双抗是将两种不同特异性的抗原结合域融合在单条多肽链或单套形成配对的轻重链中，同时保留了Fc区域，由一对相同的多肽链或配对轻重链组成对称的结构。它们虽然比较接近于天然抗体，但在分子大小和结构上与后者仍有所不同。这类双抗在常规的抗体分子结构上又融合增加了抗体片段，这往往会增大抗体的体积，改变天然结构下抗体的性能（如稳定性、溶解度等），从而可能对双抗的理化和/或药代动力学特性产生不利影响。对称模式的双抗多数采用了4价2 2的结构，但在这种结构下，如果抗原结合部位过于邻近，可能会影响与两种靶点同时结合的效率。DVD-Ig、Two-in-one等技术平台都属于对称模式。DVD-Ig技术由Abbott公司开发，其结构是在正常IgG抗体轻链和重链的N末端分别再接入另一个抗体的VL和VH结构域，产生一个对每个抗原各有两个结合位点的四价分子，通过两个可变区结合双靶点来实现双功能。DVD-Ig双抗与正常单抗具有相同的Fc区，可以采用现有通用抗体技术进行生产。Two-in-one技术最早由Genentech公司Bostrom等提出，通过对可变区进行工程化改造并通过噬菌体展示技术获得识别两个不同靶点的双特异抗体，又称为DAF抗体（Dual Action Fab，DAF）。Genentech公司将与HER2靶点特异性结合的商业化抗体Herceptin进行优化，使其能与VEGF特异性结合，同时保留与HER2的结合能力，从而实现了一个抗体同时结合两个靶点。Two-in-one双特异性抗体具有正常IgG抗体的结构，稳定性良好，易于进行产业化生产，在下游生产工艺、制剂开发和体内药动学等方面具有突出的优势，技术难点在于前期的工程化过程。不对称模式的数量要较对称模式更多，其中有相当一部分采用了类似于天然抗体的结构，以尽可能保留天然抗体所具有的优点，比如最低免疫原性的潜力，但这同时也会破坏H2L2的对称结构，引入前文所述的链相关问题。因此，大多数不对称模式是基于在共表达四种多肽链或三种多肽链（如采用共同轻链技术）时促进重链异源二聚化和/或轻链和重链正确配对的策略下而开发的。双抗的重链异源二聚化通过对Fc区域进行工程化改造，可以将两条不同但互补的重链结合，形成重链间的正确配对，常用的技术有基于空间位阻作用的杵臼结构（Knobs-into-holes，KiH）和基于静电操纵相互作用的ART-Ig技术。重链异源二聚化技术可以使H2L2结构组合由原本的10种结构缩减到其中的4种。KiH技术将双抗其中一条重链上CH3区的一个体积较小的苏氨酸（T）突变为体积较大的酪氨酸（Y），形成突出的“Knobs”型结构（T366Y），同时将另一条重链上CH3区的一个较大的酪氨酸（Y）残基突变成较小的苏氨酸（T），形成凹陷的“holes”型结构（Y407T），利用“KiH”结构的空间位阻效应实现两条不同重链间的正确装配。KiH结构可以使双抗重链的正确装配率达到90%~95%，达到规模化生产的要求。这项技术由Genentech公司于1997年开发，目前专利已过期，成为了双抗开发中最常用的技术之一，并且经常作为基础平台与其他技术结合形成新的平台。ART-Ig是基于静电操纵相互作用的代表技术，由Roche公司的子公司Chugai开发。该技术用带负电荷的天冬氨酸或谷氨酸取代一条重链上CH3区中的一个残基，并用带正电荷的赖氨酸取代对应另一条重链上CH3区中的一个残基，不同重链之间通过异性电荷相互吸引促进重链异源二聚体的形成，而相同重链之间则通过同性电荷相互排斥来抑制同源二聚体的形成。尽管对双抗的Fc区域进行工程化改造可促进正确的重链异二聚化，但使用两条不同的轻链仍会导致4种不同组合的产生，而其中只有1种是目标双抗分子。因此，共同轻链技术和CrossMab技术等被开发用于促使轻链和重链的正确配对。共同轻链技术设计的双抗仅有一种轻链，但它与两种不同的重链均能配对，直接消除了轻链和重链错配的问题。这项策略源自针对多种抗原的噬菌体展示筛选研究的发现，其中的抗体通常共享相同的VL结构域。共同轻链虽然在设计和表达上比较方便，简化了工业生产中的抗体工程和纯化过程，但限制了抗体筛选和构建的灵活性。Roche公司开发的CrossMab技术是在KiH结构基础上，将双抗的一个Fab结构域中的CL与CH1互换，而另一个Fab结构域则保持不变。CL和CH1的结构类似，因此互换位置对抗体功能影响较小；而经过改造的Fab结构域的轻链不易与另一个正常Fab结构域的重链发生错配，从而实现轻链和重链的正确配对。Roche公司以CrossMab技术开发了代表产品RG7221和RG7716，两者均为抗Ang-2/VEGF的双抗产品。上述的技术平台代表了双抗技术的经典策略，在此基础上经过不断地改进和组合，逐渐衍生出一批新的技术平台，推动着双抗技术进入到了如今百花齐放的阶段。伴随着双抗在全球制药行业掀起的热潮，国内的多家企业也已抓住时机布局双抗领域，开发出了以YBODY、CRIB、ITab、FIT-Ig、WuXiBody、SMAB、PACbody等为代表的一系列各具特色的双抗平台。图片来源：Zhang J., Antibody Therapeutics [J] 2020友芝友开发的YBODY是一种不对称的双抗平台，通过融合KiH和电荷相互作用两种策略实现重链的正确配对，同时一侧采用传统Fab，另一侧采用scFv，以避免轻链错配问题。基于该平台的双抗由三条多肽链组成：一条重链（HC）、一条轻链（LC）和一条单链（SC），形成三个片段。第一个片段是靶向TAA的Fab，第二个是靶向免疫相关抗原（IAA）的单链可变片段（scFv），第三段是可结晶的异二聚片段（Fc）区（图8A）。这三种工程技术的整合确保了目标异源二聚体双抗在CHO细胞中的良好表达，以及通过色谱法对目标双抗产物的下游纯化。康宁杰瑞开发的电荷排斥增强双特异性（CRIB）平台通过调整不同Fc链之间的电荷分布以构建异源二聚体（图8B和8C）。基于该平台构建的双抗分子保持了完整的抗体分子框架结构，在热稳定性以及Fc生物学活性方面接近于天然抗体。健能隆（Generon）开发的免疫治疗抗体（ITab）的结构相对复杂，整体为单链设计，两个scFv融合到抗CD3的Fab的两条链上，整体可设计为双特异性或三特异性抗体（图8D）。ITab旨在产生可直接激活T细胞的双抗。它同时与CD3和特定的肿瘤表面抗原结合形成免疫突触，以招募并激活肿瘤部位的T细胞。ITab双抗可以驱动T细胞扩增，使其成为肿瘤细胞的连环杀手。岸迈生物开发的四价Fabs串联免疫球蛋白（FIT-Ig）技术将两种亲本抗体的功能整合到一个分子中（图8E）。它是将两个Fab分别连接在抗体两个重链的N端，但将新的Fab抗体臂的功能区进行互换，即新Fab的轻链CL和重链CH1互换，形成了相对分子量约为250kDa的四价蛋白，构建时是用3个片段共同转染到一个细胞里。FIT-Ig双抗没有Fc的突变，也没有单链抗体和linker等不稳定因素的引入，临床前表现出较好的药效和成药性。药明生物开发的WuXiBody平台的技术核心是通过TCR的恒定区替换Fab的恒定区，以确保双抗的轻链和重链正确配对。该平台可将几乎任何两个单抗序列对组装成双特异性构建体。它的结构灵活性使该平台可方便地构建1 1不对称的二价双抗（图8F），2 1不对称的三价双抗（图8G）和2 2对称的四价双抗（图8H）。基于WuXiBody平台，药明生物目前已与天境生物、腾盛博药、英国OBT等多家企业建立了双抗项目的合作。金斯瑞开发的SMAB平台是籍由VHH与单克隆抗体的融合而设计的双抗技术平台，它使用全天然成分来实现二价和多价目的。在SMAB结构中，VHH可以连接到单克隆抗体的每个肽的N端或C端（图8I–L），使其具有通过“即插即用”方式构建多价分子的高度灵活性。基于VHH的SMAB平台具有体积小、功能强大且有效的特点，因此也具有与“隐藏”表位（例如在酶腔中、离子通道内等）结合的潜力。凡恩世开发的PACbody平台通过移动一侧Fab的二硫键位置来实现轻链和重链的正确配对，同时结合KiH技术来避免重链错配。PACbody具有类似单抗的天然结构。图片来源：Labrijn A. F., Nature Reviews Drug Discovery [J] 2019全球迄今有三款双抗药物被批准上市。首款药物Catumaxomab在2009年被EMA批准上市后，经历了2017年退市停产，随后又由凌腾医药从Trion公司引进并于今年在国内获批开展临床试验。另外两款双抗药物Amgen公司的Blinatumomab和Roche公司的Emicizumab占据了目前全部的双抗市场，在2019年的全球销售额分别达到了3.12亿美元和15.2亿美元。Emicizumab此前曾获突破性药物、孤儿药和优先审批资格，预测未来的销售额还有较大的增长空间。除了上述三款药物外，Janssen已于2020年12月向FDA递交了EGFR×cMET双抗Amivantamab的上市申请，而全球正在研发中的双抗项目已不在少数。据统计，截至2020年6月，全球范围内约有165种双抗处于临床开发阶段，以及约270种处于临床前开发阶段，并且新增项目的数量保持着快速增长。进入临床开发阶段的双抗项目多数仍处于临床早期研究阶段（67%处于临床I期，28%处于临床II期），仅有9个双抗进入临床III期。在适应症方面，约有84%是用于治疗癌症，有部分双抗正在被开发用于治疗自身免疫系统疾病。在双抗的设计策略方面，近半数的双抗是通过CD3激活T细胞或者通过CD16激活NK细胞来杀伤肿瘤细胞；另外一个普遍的策略是特异性地限制双抗的作用条件，使其仅对肿瘤具有杀伤效果，从而降低对正常细胞或者组织的损伤。目前投入到双抗药物开发的企业中，Amgen拥有为数最多的临床开发阶段的双抗项目，其次是MacroGenics、Eli Lilly、Janssen（属Johnson&Johnson旗下）、Roche、Sanofi以及Xencor。国内也已有多家企业在双抗药物的开发领域进行了布局。除了上文介绍的依靠自主开发双抗技术平台进行研发以外，授权合作也是现阶段国内双抗开发的一大特点。合作的方式通常有引进管线的开发和商业化权益，以及使用合作伙伴的双抗技术平台筛选药物分子。由公开披露的交易数量统计，双抗领域的合作开发和管线引进的数量近年来呈现快速增长的趋势，2014年仅发生1例，而在2018年已增长为12例。在双抗开发的靶点方面，与平台创新相比，靶点组合的创新则稍显乏力，主流策略仍然是快速跟进国外的研究进展，采用同样的靶点组合或基于联用治疗的背景加以组合，目前主要集中在CD3和免疫检查点，如PD-L1×TGF-β的靶点组合目前至少有3家药企跟踪。信达生物、康宁杰瑞、科望生物、恒瑞医药、岸迈生物、友芝友、百利药业等十余家企业已有双抗药物进入临床或者处于临床申报阶段。自2017年底友芝友开发的M802于被批准为国内首个开启临床试验的双抗起，截至2020年10月，国内已有29款双抗（包括百利药业的两款四抗）正在临床开发中或获得了新药研究（IND）的批准。在其中已披露适应症的28款双抗中，除了一款是针对湿性年龄相关性黄斑变性外，其余均用于基于免疫肿瘤学（IO）的癌症治疗，有21种双抗针对实体瘤，6种针对血液肿瘤，包括淋巴瘤和癌症引起的恶性腹水。图片来源：Zhang J., Antibody Therapeutics [J] 2020；公开资料我国布局双抗的药企和生物技术公司通过自主开发技术平台、快速跟进、授权合作等方式大力拓展双抗项目的研发管线，推动目前国内的双抗研发进入到了快速发展阶段。在短短的三年间，国内已有近三十款双抗进入了临床阶段，并且新进项目的数量保持着增速。在如此密集的资源投入下，可以预期我国的双抗产业在近几年内将会提升一个台阶。然而，作为一种前沿技术，双抗药物开发所面对的挑战远超单抗。药明生物（WuXi Biologics）的聂思惟博士等专家在Antibody Therapeutics发表的论文总结了设计鉴别有潜力的新型双抗或者多抗的三个原则，即双抗分子结构设计应该由独特的生物学机理驱动、双抗的构建模式应该和生物学机理匹配、选择一个可以进入临床研究的理想双抗分子；以及六个要素，即理想的临床疗效、合适的安全性、合理的药代/药效动力学、合理的理化特性、易于临床和商业化生产、尽可能小的免疫原性。尽管如此，目前很多双抗在研发阶段并未完全遵从或选择忽视了它们，其原因可能在于生物功能的相关指标（如有效性、安全性、药代/药效动力学和免疫原性）和可开发性指标（如表达水平、可溶性、稳定性、粘度等）往往并不完全相关，有时甚至相互矛盾。值得注意的是，虽然目前国内的双抗项目发展的风生水起，甚至已涌现出了如百利药业全球首创的四抗项目，但进展最快的仍处于临床II期阶段，大浪淘沙后究竟能够留下多少双抗可以得到认可并走向市场，目前尚未可知。因此，如何全面平衡各项要素的特点，设计出能够既具有良好的药效，又能符合生产化、商业化标准的双抗分子，是决定后期临床开发的成功率的基础。在双抗的靶点选择方面，尽管靶点的组合可以呈现出丰富的多样性，但由于双抗的研发壁垒高，国内的双抗靶点的主流选择仍然是采用快速跟进的策略。假如长此以往，未来发展很可能会导致资源过度集中在热点赛道，重现PD-1/PD-L1竞争过热的窘境，也导致研发、临床、资金等资源的浪费。目前国内双抗开发仍以CD3、PD-1/PD-L1、CTLA-4及HER2为靶点的项目居多。因此，在加速推进管线研发进度的同时，也应重视对靶点组合进行合理的差异化布局，分散竞争压力。聚焦于肿瘤疾病是目前双抗研发的另一项特征，而通过T细胞招募杀伤肿瘤细胞又是实现这一目标的主要策略。虽然这在目前是效率最高的双抗开发途径之一，但同时也限制了对靶点组合的选择范围。研究者也在不断探索双抗在其它疾病领域的治疗潜力，如病毒和细菌感染、骨质疏松症、糖尿病、自身免疫缺陷病等，通过动物试验的研究已发现双抗在Ebola病毒感染、提高血脑屏障的透过率等方面都有良好的效果。致力于双抗开发的企业不妨可以考虑在这些方向继续挖掘双抗的潜力，充分利用双抗的多重优势，同时结合自有双抗技术平台的特点（如半衰期长短、分子的大小、靶点结合的特异性等），将双抗技术应用于更广阔的疾病领域，从而创造出能够独领风骚的赛道。双抗技术经过多年的积累，至今已有了长足的发展，一众药企和生物技术公司基于各自的技术特点已开发出数十种技术平台，这些技术平台各有优势，也各有不足，仍值得继续研究和优化，进而发展出兼具成药性、生产工艺可行性和可放大性的平台技术，使双抗技术真正走向成熟。作为一项前沿技术，相信双抗技术能够做到厚积薄发，孵化出更多高效的治疗药物，为人类的健康带来福音。参考资料：
1、Labrijn A. F. et al. Bispecific antibodies: a mechanistic review of the pipepline. Nature Reviews Drug Discovery [J] 2019.
2、Zhang J. et al. Development of Bispecific Antibodies in China: Overview and Prospects. Antibody Therapeutics [J] 2020.
3、Nie S. et al. Biology drives the discovery of bispecific antibodies as innovative therapeutics. Antibody Therapeutics [J] 2020.
4、Wang Q. et al. Design and Production of Bispecific Antibodies. Antibodies [J] 2019.
5、Zhang J. et al. Development of Bispecific Antibodies in China: Overview and Prospects. Antibody Therapeutics [J] 2020.
6、太平洋证券，双特异性抗体行业深度报告：曙光初现的抗体V2.0，聚焦肿瘤领域。
7、叶金统等，双特异抗体的研究进展，生物工程学报[J]，2020。
8、生物制药小编，双特异性抗体。
9、宋社吾，双特异性抗体的研发难点梳理和前景展望。
主题：十年市值四千亿, mRNA 产业如何变革制药界
时间：2021年3月3日周三 19:30-20:30
浙江大学本科，后于哈佛医学院拿到博士学位，其博士期间的导师为《我不是药神》中神药格列卫的发明者之——汤姆·罗伯茨教授。
攻读博士期间，童博参与了哈佛医学院附属肿瘤医院在脱氧核糖核酸、核糖核酸，人乳头瘤病毒及肿瘤疫苗的研发，以及诺华小分子药、抗体药、生物药在乳腺癌、肺癌、结肠癌和肝癌中的开发，临床试验设计等工作，积累了丰富的科研经验，成功推进多项临床试验和多项药品的上市。
博士毕业后，加入了美国波士顿知名的旗舰医药投资公司Flagship Pioneering，期间主要负责生物医药企业的孵化、项目开发、上市等运营工作。其间，童博士负责的成功上市案例包括NSDQ: MNRA、ALNY、SYRO、MCRB、SRTP等。
