综述 | Plant and Soil ：植物响应低磷胁迫的根系有机酸分泌：研究进展、挑战和展望
编译：阿昊，编辑：小菌菌、江舜尧。
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背景：为了提高植物磷（P）吸收效率，保障农业可持续发展，提高根际植物可直接吸收磷浓度是一个重要的问题。根系分泌有机酸是活化土壤磷含量的一个关键策略。
范围：本文综述了有机酸对土壤磷活化作用和相关的研究方法。然后讨论了低磷诱导的根系有机酸分泌及其对土壤磷活化和植物磷吸收的贡献，并指出了该研究领域的影响、挑战和前景。
结论：在低磷条件下，有些植物的根系有机酸分泌量显著增加，也有一些植物根系分泌物增加量并不显著。根际有机酸对提高植物速效磷有重要作用，但其贡献受多种因素影响。在未来的研究中，改进根系分泌物取样和分析方法，利用成熟叶片锰（Mn）浓度或总14C分泌量作为根际有机酸含量的指示指标，不同田间个案试验，低磷条件下有机酸合成与分泌的分子调控机制值得进一步关注。最后，在作物育种过程中应考虑植物不同适应策略之间的碳消耗并聚合多个有利根系性状（如多根毛加高根系分泌物含量）以培育磷高效品种。
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综述目录
1.有机酸阴离子提高土壤磷有效性的机理探讨
2.研究方法
3.低磷诱导的根系有机酸分泌
4.有机酸分泌与土壤磷活化/植物磷吸收的关系
5.分泌的有机酸是否总能促进磷的活化和吸收？
6.根系分泌有机酸对土壤磷活化和植物磷吸收贡献的影响因素
7.低磷条件下有机酸分泌研究的其它挑战
主要内容
1.有机酸阴离子提高土壤磷有效性的机理探讨
有机酸或其阴离子是指至少具有一个羧基（COOH或COO-）的一类含碳化合物，本文主要关注低分子量有机酸，如柠檬酸、苹果酸、丙二酸和草酸。由于土壤pH值和有机酸解离特性，这些酸大多以完全解离的阴离子形式存在于土壤中。例如，大约80%的柠檬酸以柠檬酸盐3-阴离子形式存在，99%的苹果酸在pH 7下以苹果酸2-阴离子形式存在（故根系分泌的是有机酸，然后在土壤中就是有机酸阴离子）。简单地说，有机酸阴离子可以通过与无机磷和有机磷竞争土壤吸附位点，配体促进的矿质营养溶解和富集植物促生微生物来提高土壤磷的有效性，如图1所示。
图1.有机酸阴离子对土壤磷（P）活化作用的示意图。在根际中可以通过以下方式增加植物可直接吸收磷：（1）通过占据土壤磷吸附位点释放土壤吸附的磷酸根；（2）通过与阳离子形成络合物来改变矿物溶解速率；（3）促进土壤微生物（如细菌和菌根真菌）的增殖和定殖，这些微生物反过来可能会分泌磷活化化合物（例如有机酸阴离子和磷酸酶/植酸酶）。
1.1 吸附位点的竞争
有机阴离子可以占据土壤矿物质的吸附位点，而这些矿物可能与有机磷离子和无机磷离子结合，并在这些吸附点上取代磷酸根。释放的无机磷可直接被植物根系吸收，而有机磷可被磷酸酶水解进而释放无机磷酸根。一般而言，碱性磷酸酶和酸性磷酸酶活性的最佳pH值分别为pH值8–10和pH 4–7，具体取决于底物类型、底物浓度和所用缓冲液。磷酸酶在土壤和植物组织中的磷活化和磷循环起着重要的作用，但是它们催化水解有机磷的具体机制还没有得到充分的研究。
1.2 配体促进矿物溶解
有机阴离子可通过以下方式改变矿物溶解速率：1）通过降低溶液pH值改变矿物溶解速率，使其远离平衡状态，或在矿物表面与铁、铝等阳离子形成络合物，从而影响吸附的磷酸盐阴离子的结合强度；2）影响溶液的饱和状态（如化学亲合作用当有机阴离子与溶液中溶解的铝形成络合物时，Al3+的亲和力降低；3）影响离子（如Al3+）在溶液中的物种形成，其本身会影响矿物溶解速率。以前认为有机阴离子的分泌可能导致根际酸化。然而，人们已经清楚地认识到有机阴离子分泌和根际酸化是两个在空间上相互协调的独立生化过程。在白羽扇豆（Lupinus albus）的簇根中，伴随有机酸阴离子释放的阳离子大多是K+、Na+和Mg2+。一般来说，有机阴离子在根际酸化中起次要作用，根际pH值取决于根系排出的HCO3-、OH-和H+，这是由根吸收阳离子和阴离子的平衡决定的。
1.3 与植物促生菌的相互作用
有机酸阴离子可以为土壤微生物提供碳源。这可能刺激根际细菌和真菌菌丝的增殖。一些细菌是促进植物生长的根际细菌，可以释放有机阴离子和磷酸酶来活化土壤磷或分泌植物激素来促进根系发育，从而提高磷的吸收。当根被丛枝菌根真菌或外生菌根真菌定殖时，菌根菌丝是植物吸收磷的主要方式。此外，外生菌根菌丝也可能向土壤中分泌草酸及一些酶来活化土壤无机磷和有机磷。
2.研究方法
由于根系分泌物与土壤微生物群落以及土壤颗粒之间存在复杂的相互作用，根系分泌有机酸的研究经常受到分泌物取样方法及其定性定量方法的挑战。例如，在有菌条件下，外源碳迅速降解，根分泌物浓度低于检测限，而在无菌的根系环境中，外源碳水平相对稳定或下降得比有菌水培系统慢。迄今为止，针对具体的研究问题，有各种各样的根系分泌物采样和测定方法，每种方法都有其优缺点。在这里，我们着重介绍在植物磷吸收的根系分泌物研究中常用的植物栽培系统和分泌物收集体系，并探讨使用成熟叶片锰浓度或总14C分泌量作为根际有机酸阴离子含量的指示作用。
2.1 植物栽培体系
目前为止，使用营养液水培、使用土壤或河沙盆栽和使用土壤的根箱体系是最常用的植物栽培系统（表1）。大多数研究是在精控温室中进行的，部分研究使用真实的农业土壤，只有少数研究在农田进行。水培作为一种根系环境影响着许多作物的根系形态，温室条件限制了对大田条件下可能发生的情况进行真实的估计。野外试验面临着许多挑战，比如采样方法和环境因素，如降雨、气温和杂草等。
表1 低磷胁迫诱导有机酸分泌研究所使用的不同植物培养体系和植物生长培养基的优缺点。
2.2 根际分泌物收集
根系分泌物收集溶液（Trap solutions）的组成是一个重要因素，可能导致对分泌物和/或收集到的化合物的分子组成有偏差（表2）。一般来说，对于水培，水在短时间内（<2小时）被用作收集液；根系似乎不会受到超纯水的伤害，并且在2小时内不会出现明显的分泌物降解。对于以土壤或沙子为介质的植物栽培系统，0.2 mM CaCl2溶液通常用作收集液以确保根系不受渗透压变化伤害。尽管Micropur是一种抑菌化合物，在收集分泌物的过程中，可能会干扰根系的新陈代谢或抑制分泌过程，但通常在分泌物收集之后添加到溶液中以抑制根系分泌物的微生物降解。
表2 不同有机酸收集液成分比较。
2.3 利用成熟叶片锰浓度或总14C分泌量作为根际有机阴离子含量的指示物
释放大量有机酸的植物的成熟叶片往往具有相对较高的锰浓度，因为有机阴离子也可以活化一些过渡态金属阳离子，特别是铁、锰、锌和铜。最近的一项盆栽研究使用100份不同遗传背景的鹰嘴豆（cicerarietinum）为材料发现成熟叶片锰浓度与根际有机酸阴离子含量呈正相关。在另外一项温室研究中，薄荷树（Agonis flexuosa）也有类似的相关性。此外，如果根际微生物消耗了有机阴离子，则叶片锰浓度并不高。表明成熟叶片锰浓度可以作为根际有机阴离子含量的一个易于测量的指示指标，如图2所示。这为低磷条件下根际有机阴离子含量的评价提供了一个新的、简单可靠的工具。但在使用这种替代指标时，最好注意除根际有机酸以外的一些影响叶片锰浓度的因素。例如，叶片蒸腾速率、根系大小（包括总根长、根表面积、根毛圆柱体积和叶片寿命）都可能对叶片锰的积累有贡献。此外，一些植物物种（例如水稻和羽扇豆）可积累高浓度的锰而不表现出毒性，一项关于外部pH值对湿地水稻吸收锰的影响的研究表明，较低的pH值（从7到3）会降低根和地上部的锰浓度。尽管根系分泌的有机酸在根际酸化中起次要作用，但我们不能忽视低磷条件下pH对植物锰吸收的影响。因此，建议进一步研究不同植物物种（特别是作物物种和锰超积累者）在不同的生长条件下（尤其是农业土壤和田间条件）根系分泌有机酸与叶片锰浓度之间的关系。
另外一些研究用14CO2标记大豆（Glycine max）和绿豆（Vigna radiata）发现低磷条件下根系分泌物中的有机酸含量与总14C分泌量显著相关，有机酸含量占总碳分泌量的很大比例（>50%）。这些研究液为有机酸的定量提供了一种快速而简单的技术。然而，这种方法需要一个特殊而复杂的腔室（由于使用了碳同位素），并且只能在植物生长的早期阶段使用。此外，水培系统是最适合这种体系的植物栽培系统。因此，这些因素可能会严重影响其在更广泛的物种、植物发育阶段和生长条件中的应用。
3.低磷诱导的根系有机酸分泌
很多但并非所有研究物种在缺磷条件下可显著诱导根系分泌有机酸，即使是同一物种，品种或基因型之间也存在差异（表3）。根系分泌有机酸的组成变化很大，取决于植物种类。苹果酸和柠檬酸似乎是缺磷条件下根系分泌的主要小分子有机酸（表3）。不同的有机酸在土壤中表现出不同的磷活化能力；柠檬酸盐在大多数情况下是最有效的。白羽扇豆（Lupinus albus）是一种非常有效的可利用根系分泌柠檬酸来应对缺磷胁迫的作物。最近的研究表明，燕麦（Avena sativa）根在水培条件下也能表现出快速的柠檬酸分泌速率，并且在低磷土壤条件下根际积累了高浓度的柠檬酸盐。这一点特别有意义，因为一般来说禾本科植物在低磷条件下不会表现出快速的有机酸分泌速率。
4.有机酸分泌与土壤磷活化/植物磷吸收的关系
长期以来，人们一直假设根系分泌的有机酸在植物不可直接吸收磷活化转化方面起着关键作用。事实上，许多研究已经证实了这一假设。
4.1 向土壤中添加有机酸
土壤有机磷和无机磷均可通过添加有机酸或有机阴离子来活化。然而，有机阴离子对土壤磷的活化效率取决于多种因素，如有机阴离子的种类、浓度以及土壤性质。例如，pH值和醋酸盐（0至2μmol g−1土壤）对磷酸盐溶解度均无影响，但添加二价和三价有机酸阴离子可使磷酸盐溶解度有所增加，且这种影响随有机酸阴离子浓度的增加而增加。在pH值为5.5和7.5的条件下，添加1 mM和10 mM柠檬酸钾增加了所有七种受试土壤中的磷溶解度。活化的浓度依赖性是非线性的，因为10倍的柠檬酸盐浓度只会使磷释放增加不到2倍。高浓度的有机酸阴离子有可能表现出更强的磷活化效果。土壤化学性质如铝和钙的含量对有机酸活化磷有很大的影响。当土壤有机质含量较高时（如森林土壤），有机阴离子对有机磷的活化作用比无机磷的增溶作用强；而当土壤有机质含量处于中低水平时，则相反。然而，还需要进一步的研究来证明这一点。关于pH值对有机酸活化磷的影响，目前还没有一致结论，需要进一步研究。
4.2 根际有机阴离子与磷吸收的相关性研究
研究者使用含有不同程度和浓度可溶性磷源的河沙作为植物生长介质，通过将整个根系和附着的根际土壤浸没在收集液中对根系分泌物进行采样发现3种多年生豆科植物和9种豆科植物根际有机阴离子含量与叶片全磷含量呈极显著正相关。在挪威东南部，用两个长期施肥试验（分别自1966年和1922年以来未施用磷肥）的农田中的农业土壤进行了小型根箱试验。他们发现，植物生长5周后，低磷土壤根际乳酸铵可萃取P（植物可利用磷，PAL）略有增加；几乎所有根际水溶性P浓度都比未种植的土壤有所增加，油菜（Brassica napus）根际水溶性磷含量最高。同一研究中的相关分析表明，根际柠檬酸含量与油菜和马铃薯根际水溶性磷含量成正相关。此外，他们还发现，低磷条件下，油菜和燕麦（Avena sativa）比马铃薯和小麦（Triticum aestivum）获得更多的磷。然而，也有一些研究表明根际有机酸阴离子含量与植物磷吸收没有明显的相关性。
4.3 转基因植物增加有机酸分泌
有机酸分泌可提高植物磷吸收在转基因植物中也有相关研究。当生长在含有磷酸铝、磷酸铁或磷酸钙的水培溶液中，与对照相比，超表达青霉菌苹果酸脱氢酶基因的烟草（Nicotiana tabacum）分泌更多的苹果酸，产生了更高的生物量和磷吸收。此外，在油菜中过量表达绿脓杆菌柠檬酸合成酶基因时，转基因株系表现出柠檬酸和苹果酸分泌增强，并且当生长在缺磷的水培或土壤中时，提高了植物磷的吸收。此外，表达小麦苹果酸转运蛋白TaALMT1的转基因大麦（Hordeum vulgare）在水培条件下也表现出增强的Al3+诱导的苹果酸分泌，并且在酸性土壤中提高了磷的吸收和产量。
4.4 间作、轮作对有机酸分泌的影响
5.分泌的有机酸是否总能促进磷的活化和吸收？
土壤中的有机酸阴离子对植物磷吸收有重要作用。然而，在某些条件下我们并不认为根际有机阴离子与植物磷的吸收之间存在密切的相关性，如：
1）植物在低磷条件下分泌的有机阴离子很少（如表3所示）；
2）根系分泌到土壤中的有机阴离子被土壤颗粒迅速吸附或被土壤微生物降解。
最近的一项研究表明，在土壤中添加低至中等浓度的柠檬酸（<50μM）反而降低了土壤磷的有效性，这是由于某些土壤类型中无机磷酸盐离子和柠檬酸的“Ca辅助共吸附”。添加更高浓度的柠檬酸会逐渐补偿较低浓度下柠檬酸的有害影响，这种情况下柠檬酸阴离子和PO4对相同吸附位点的竞争起着主要作用。也就是说，只有当根际中“有效”有机阴离子的含量很高时，根际有机阴离子对土壤磷活化和植物磷吸收才有显著的贡献（图2）。
表3.不同磷条件下不同种类植物有机酸分泌。
图2.影响根际有效有机阴离子含量的因素，根际有机阴离子与土壤磷（P）活化、植物磷吸收以及叶片锰（Mn）浓度的关系。只有当根系释放出大量有机酸，而土壤微生物分解和土壤吸附所损失的有机阴离子量较低时，根际“有效”有机阴离子的含量才高，从而促进土壤磷活化和植物磷吸收，并提高叶片锰浓度。少量有效的根际有机阴离子对土壤P、Mn的活化作用不明显。黑色箭头表示正面或促进作用；灰色箭头表示负面或微弱影响，白色箭头表示正面和负面影响都有。
6.根系分泌有机酸对土壤磷活化和植物磷吸收贡献的影响因素
最近的一篇综述总结了根系分泌物研究中的一些挑战，如采样时间、分泌物收集时间、取样位置、植物发育阶段、植物类型和菌根类型。在这里，我们重点讨论在理解根系分泌有机酸对土壤磷活化和/或植物磷吸收的贡献方面所面临的影响因素和挑战。
6.1 有机酸采样
一般来说，由于使用的收集液、采样方法、土壤吸附、土壤微生物活性和分析方法，文献中呈现的有机阴离子浓度可能会偏离真实值。一些有机阴离子可能来自于受损的根系；并非所有根际土壤都可用于提取有机阴离子；不同的土壤性质具有不同的吸附能力，土壤微生物可降解有机阴离子或将有机阴离子释放到土壤中。有机阴离子的“不准确”数据可能会影响结论。因此，准确和具有生态意义的采样程序对于理解有机阴离子在土壤磷活化和植物磷吸收的作用至关重要。最近，一种新的工具，允许对根系分泌物进行非破坏性的连续重复取样，为评估土壤植物根系分泌物分泌速率提供了新的机会。
6.2 植物种类和基因型
如上所述，植物物种和基因型在根系分泌物对低磷胁迫响应有所不同，这可能导致已发表的论文中得出相反的结论。各种策略如菌根、根分泌物、根形态和结构在不同物种中进化。一般来说，当根际有适宜的有效磷含量时，植物倾向于采用根系结构或菌根定殖策略来获取土壤磷；反之，当有效磷含量极低时，根系分泌物更能有效地提高根际磷的有效性，从而提供足够的有效磷P被提取。例如，当豆科植物在河沙中生长时，以KH2PO4（0至384 μg P g−1土壤）供应8种水平的P，在6 μg P g−1土壤中，11种受试物种的磷吸收与根表面积和总根长之间存在良好的相关性，而在0 μg P g−1土壤中则没有。
6.3 植物发育阶段和植物组织磷含量
植物在不同的发育阶段对磷有不同的需求，一般来说，种子萌发期和幼苗早起优先利用种子储藏的磷而对土壤磷需求较低，接着需求增加至开花期，种子成熟期对磷的需求再次降低，但不同的植物有不同的磷需求发育阶段。不同发育阶段对磷的需求差异导致植物组织内磷浓度的差异，这些也改变着植物对土壤磷需求进而调节着根系有机酸分泌。
6.4 碳消费与平衡
植物适应低磷的策略比如根系发育、根系分泌物、与土壤微生物互作等过程均需要消耗植物光合作用固定的碳源。一般来说，根毛发育需要的碳最少，而分泌物和与真菌共生消耗的碳最多，为了更有效的利用植物光合固碳，植物在特定土壤等环境条件下会考虑最有效的策略，比如土壤有效磷含量相对较低时可以促进侧根和根毛产生以增加土壤接触面积从更多的土壤中获取磷，而当土壤有效磷含量非常低时，植物需要分泌有机酸以及磷酸酶来活化土壤磷。需要注意的是，一种策略占优势时另外一种策略可能受到抑制，比如植物与丛枝菌根共生后会抑制根系有机酸分泌。
6.5 土壤吸附与土壤微生物
7.低磷条件下有机酸分泌研究的其它挑战
7.1田间试验
长期以来，有机阴离子与磷吸收的研究主要集中在温室内，以水培、河沙或土壤为生长介质。大田研究较为鲜见。在一项大田试验中，研究者在每个地块随机选择20 cm×20 cm采样区，从3棵没有明显根系损伤的植物的根系和附着根际土壤中取样。根据根干重对根际有机酸含量进行归一化处理，其结果表明在相同德植物发育阶段和相同土壤条件下大田实验与温室根箱试验结果吻合较好。因此，该研究为在大田条件下开展这类研究提供了一个成功的范例，可用于不同植物生长阶段的长期监测和研究。后期开展更多的不同条件下的田间试验，对丰富农业知识，促进农业粮食生产和可持续农业具有重要意义。
7.2 有机阴离子生物合成和分泌的分子调控机制
在过去的几十年里，已经发现了数千个响应低磷胁迫的差异表达基因。植物感知低磷胁迫、磷转运、磷吸收和磷代谢的分子机制已经阐明。有机酸主要通过柠檬酸循环产生，在较小程度上通过乙醛酸循环产生。然而，低磷诱导有机酸分泌的分子机制尚不清楚。这使得利用作物育种和基因工程技术通过提高根系分泌物来促进磷吸收变得困难。在最近的一项研究中检测到了大量的与柠檬酸和乙醛酸相关的酶。此外，对磷高效和磷低效大豆的根系蛋白质组学分析发现了许多差异表达的蛋白质，其中包括许多参与有机酸合成的酶，如苹果酸脱氢酶和异柠檬酸脱氢酶。研究一些候选基因在调节有机酸合成和分泌中的作用是很有意义的。
7.3 根分泌物中的未知化合物
由于研究方法的局限性，低磷诱导的植物根系分泌物（尤其是低含量的）中可能有许多未知化合物。根系分泌物含有大量的植物化学物质，一些化合物作为化感物质调节植物和土壤微生物（包括细菌、真菌和线虫）之间的相互作用。这反过来可能会影响磷吸收。例如，在低磷诱导的甜菜（Beta vulgaris）根系分泌物中检测到水杨酸和柠苹酸，这些化合物可以溶解土壤中的磷。另一项研究还发现，在低磷条件下，河沙种植的荷花物种会分泌出柠苹酸。此外，根系分泌的独脚金类酯具有促进丛枝菌根真菌定殖、促进寄生植物侵染和抑制枝条分枝等多种功能。因此，鉴定新化合物并研究其功能将有助于提高植物磷的吸收。
7.4 育种
培育磷高效品种是农业活动中保障粮食生产的关键。有大量的报告表明，有机酸分泌可以在低磷条件下提高植物对磷的获取；然而，一些研究表明，一个单一的根系性状可能无法解释植物对不同形式的难溶磷的吸收。在传统育种或基因工程获得磷高效品种的过程中，应将其它根系性状与根系分泌物相结合。例如，在低磷条件下，培育根毛密度增加、根系分泌物增强的品种具有以下优点：通过根毛提高磷的吸收，通过分泌的有机阴离子增加根际植物有效磷浓度，以及通过最大和最小碳成本相结合的方式节约碳的使用。
结论
为了提高植物磷吸收效率、减少磷肥的施用量，保证粮食生产的可持续性，第一步也是重要的一步是提高根际可溶性正磷酸盐（“植物有效磷”）的浓度。鉴于80%以上的土壤磷对植物是相对不可利用的，对根际磷的活化研究具有重要意义和紧迫性。因此，根系分泌有机酸值得进一步研究。
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