一文带你了解双荧光素酶报告基因检测的常见应用！

背景介绍：

荧光素酶（luciferase）是自然界中能够产生生物荧光的酶的总称，其中最有代表性的是从甲虫中分离得到的萤火虫荧光素酶（Firefly luciferase）和从海肾中分离得到的海肾荧光素酶（Renilla luciferase）。由于两种酶底物和发光颜色的区别，且在动物体内无内源性表达，使其双报告基因系统在实验中得到广泛应用。

实验原理

Luciferase 报告基因系统是以荧光素(luciferin)为底物来检测萤火虫荧光素酶(fireflyluciferase)活性的一种报告系统。荧光素酶可以催化 luciferin 氧化成oxyluciferin，在luciferin氧化的过程中，会发出生物荧光(bioluminescence)。然后可以通过荧光测定仪也称化学发光仪(luminometer)或液闪测定仪测定 luciferin 氧化过程中释放的生物荧光。荧光素和荧光素酶这一生物发光体系，可以极其灵敏、高效地检测基因的表达。

图1. 荧光素酶发光原理图

应用方向

荧光素酶作为一种理想的报告基因，主要可用于miRNA与靶基因的靶向互作研究、转录因子与启动子调控机制研究、启动子活性研究等。

miRNA与靶基因的靶向互作研究：

在miRNA的研究中经常会涉及到miRNA与RNA靶向关系的验证，这其中包括mRNA中CDS区后面的3’-UTR区、LncRNA、circRNA等。miRNA通常是通过其种子区（seed region），及5’端2-8个碱基与目的RNA靶位点完全匹配结合（注：RNA之间存在U-G结合的模式），并在沉默复合体(miRNA-induced silencing complex)的共同作用下导致目的RNA降解，进而致使目的RNA的表达量下调。基于这个原理，miRNA-target 双荧光素酶报告基因系统被科研工作者普遍认可，用于验证miRNA与靶基因的直接靶向关系。

图2. miRNA与其靶向互作质粒构建方式

转录因子与启动子调控机制研究：

转录因子是一种具有特殊结构、行使调控基因表达功能的蛋白质分子，也称为反式作用因子。某些转录因子仅与其靶启动子中的特异序列结合，这些特异性的序列被称为顺式因子，转录因子的DNA结合域和顺式因子实现共价结合，从而对基因的表达起抑制或增强的作用。萤光素酶报告基因实验（luciferase Assay）是检测这类转录因子和其靶启动子中的特异顺序结合的重要手段。

其原理简述如下：（1）用靶启动子的特定片段替换报告基因质粒（如pGL3-basic）的启动子区。（2）将要检测的转录因子表达质粒与报告基因质粒共转。如果该转录因子能够激活靶启动子，则萤光素酶就会表达，且其表达量与转录因子的作用强度成正比。（3）加入特定的底物，萤光素酶与底物反应，产生萤光素，检测荧光的强度可以对萤光素酶的活性定量，进而判断该转录因子能否与靶启动子片段发生作用 。

图3. 启动子质粒构建方式

启动子活性研究：

将启动子区域序列(通常2k左右)进行分段截短，需要注意的是，构建截断体一定要从远端截断，必须保留核心启动子区域。或对特定位点进行突变，再分别构建入luciferase报告载体,检测其启动子活性。

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参考文献

1.Nicolas, F.E., Experimental Validation of MicroRNA Targets Using a Luciferase Reporter System, in MicroRNAs in Development: Methods and Protocols, T. Dalmay, Editor. 2011, Humana Press: Totowa, NJ. p. 139-152.

2.Zhu, J., et al., TNF-alpha mRNA is negatively regulated by microRNA-181a-5p in maturation of dendritic cells induced by high mobility group box-1 protein. Sci Rep, 2017. 7(1): p. 12239.

3.Zhu, S., et al., MicroRNA-21 targets the tumor suppressor gene tropomyosin 1 (TPM1). J Biol Chem, 2007. 282(19): p. 14328-36.

4.Shimono, Y., et al., Downregulation of miRNA-200c links breast cancer stem cells with normal stem cells. Cell, 2009. 138(3): p. 592-603.

项目部 邹 月▕ 文案

市场部 李文倩▕ 编辑