脂质纳米粒中脂质成分对mRNA摄取和表达的影响

近期，Anna K. Blakney教授团队在《Journal of Controlled Release》期刊2021年第330期上以题为“Effect of complexing lipids oncellular uptake and expression of messenger RNA in human skin explants”发表研究论文。
该团队利用不同的复合脂质制备脂质纳米颗粒（LNPs）递送RNA，探索了各类脂质在人皮肤移植体中如何影响细胞对mRNA的摄取和翻译，并提出了一种更模块化的递送系统。

基因治疗作为一种新型的治疗技术已经应用于多种疾病，其治疗效果高度依赖于递送系统。mRNA作为目前基因治疗研究中的热门，可用聚合物、多肽、乳剂、LNPs等作为载体。其中LNPs研究最多，也是技术较为先进的一种非病毒递送载体。通常情况下，RNA分子通过静电相互作用被包封于LNPs内，而本文表明，在LNPs表面复合RNA也是可能的，且这种制备RNA-LNPs复合物的优势在于：1）构建了一种递送RNA的模块化体系，体系中的递送载体可提前制备，给药前与治疗药物混合即可；2）有利于复合分子量更大的RNA；3）可不采用冷链运输，降低了成本，提高了制剂的可及性。

此外，该团队的研究人员证实了复合脂质的种类会决定转染效率和细胞摄取。本文利用人体皮肤模型替代通常使用的动物模型，遵从了3Rs（replacement替代，reduction减少，refinement优化）原则，且尤其适合用于皮内、皮下和局部给药。

本文用五种不同脂质与胆固醇、DOPE一起分别制备成LNPs，再在其表面复合eGFP mRNA。这五种脂质分别是属于可电离脂类的C12-200，MC3；阳离子脂类中的DDA，DOTAP；以及两性离子脂质cephalin。

复合mRNA前，LNPs带正电，复合核酸后则转变为负电荷，表明这些LNPs与mRNA都有着令人满意的结合效果。将纳米粒皮内注射入人皮肤外植体内，分别在注射4,24及72h后，利用流式细胞仪考察Cy5标记的mRNA和eGFP产生的荧光信号，探究摄取与表达的关系——发现MC3和DDA脂质纳米粒诱导mRNA高摄取而低表达；DOTAP诱导mRNA高摄取和高表达；C12-200诱导低摄取和低表达；而cephalin诱导低摄取，却有相对较高的蛋白表达（见图1）。由于脂质的不同，各LNPs的摄取和表达量有着较大的差异，但都明显高于裸mRNA组，这也再次证明LNPs是mRNA有效的递送载体。

图1.LNPs在人皮肤外植体上的评估。(A)评估mRNA脂质复合体处方的体外和体外模型示意图。(B)全层皮肤外植体图像。(C) 5 μg 裸mRNA或与C12-200、cephalin、DDA、DOTAP或MC3脂质复合物皮内注射4、24和72h后eGFP+细胞的总百分比。图中误差线代表平均值±标准差，n=3。(D)皮内注射5 μg 裸mRNA或与C12-200、cephalin、DDA、DOTAP或MC3 LNPs复合24 h后，测定eGFP+细胞群中Cy5和eGFP的平均荧光强度(MFI)

考虑到人皮肤外植体包括许多不同类型细胞，该团队进一步研究证实，eGFP在不同细胞中的表达也存在差异。五种复合脂质对各类细胞的摄取和蛋白表达影响不同。C12-200LNP促进了除B细胞、NK细胞、上皮细胞和脂肪细胞外的细胞对核酸的摄取，并表达较多的GFP。除脂肪细胞和上皮细胞低表达外，其他细胞均摄取并表达Cephalin、DDA和DOTAP LNPs-mRNA。MC3LNP能被所有细胞摄取，但NK细胞、B细胞、上皮细胞和脂肪细胞的蛋白表达低于其他细胞类型。值得注意的是，脂肪细胞在所有细胞中占比最少（0.56%），却是最先高表达eGFP的细胞。

图2.皮肤细胞中各细胞亚型的占比(A)，皮内注射复合mRNA的C12-200(B), cephalin (C), DDA (D), DOTAP (E) 或 MC3 (F)LNPs或裸mRNA（G）4,24及72h后各细胞亚型eGFP阳性细胞占比。n=3

本文还对这些复杂的数据进行处理分析，总结了每个制剂给药后观察到的总体表型模式：C12-200 LNPs摄取和蛋白表达的模式与cephalin最为相似；MC3 LNPs与DOTAP LNPs相当。裸mRNA和DDA组与其他组相比，差异较大。

图3.仅用RNA(A)或lipoplex (B-F)处理24h后，按表型分开的eGFP+(绿色)和Cy5+(蓝色)细胞的t分布随机邻近嵌入图(tSNE)

总的来说，该研究团队证明了LNPs-mRNA制剂处方中的脂质成分会影响细胞摄取和mRNA翻译，且脂肪细胞在蛋白质表达中有着重要作用。该研究结果不仅利于进一步理解mRNA表达的机制，还可能促进基因递送的新靶点研究。

亮点总结

  • 提出了一种模块化的RNA递送体系；

  • 证实了RNA治疗中皮内注射途径的潜力；

  • 证明了不同脂质可影响细胞摄取和转染效率；

  • 提出了RNA治疗未来可能的新靶标。

文章信息

Volume 330, 10 February 2021, Pages 1250-1261

https://doi.org/10.1016/j.jconrel.2020.11.033

作者信息
第一作者：
Polina Deletic是帝国理工学院的一名免疫学硕士学生。此前，毕业于莫斯科国立大学的一所医学院。
通讯作者：
Anna K. Blakney博士是不列颠哥伦比亚大学迈克尔·史密斯实验室和生物医学医学工程学院助理教授。此前，她是伦敦帝国理工学院的玛丽·斯克洛多斯卡-居里研究员，拥有生物工程博士学位。她的研究重点是开发新型生物材料，并希望将细胞生物学和材料科学应用于疫苗制剂并递送可自我扩增的RNA。目前，Anna K. Blakney博士正在进行COVID-19相关科研工作。

参考资料：

[1] W. Qu, et al, Cationic DDA/ TDB liposome as a mucosal vaccineadjuvant for uptake by dendritic cells in vitro induces potent humouralimmunity, Artif Cells Nanomed Biotechnol 46 (2018) 852–860.

[2] L.M. Kranz, et al, Systemic RNA delivery to dendritic cells exploitsantiviral defence for cancer immunotherapy, Nature 534 (2016) 396–401.

[3] L. Van Der Maaton, et al, Visualizing data using t-SNE, J. Mach.Learn. Res. 9 (2008) 2579–2625.

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