科研 | Plant cell：为什么镰刀菌Fusarium virguliforme对大豆致病而对玉米不致病？
编译：刘宁，编辑：十九、江舜尧。
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植物病原真菌在宿主植物中定殖，引起一些列植物免疫反应，同时参与宿主植物发育过程的重编辑。比较转录组学研究表明不同真菌侵染过程存在差异，但是对于适应多宿主的病原菌研究较少。有些病原真菌具有广泛的宿主范围，对于一些宿主植物来说是致病的，而对于另一些来说则是内生菌，定殖后不致病。例如镰刀菌Fusarium virguliforme侵染大豆导致大豆猝死综合症（SDS），但是也可以定殖于玉米根部而不产生症状。本研究比较了镰刀菌定殖不同宿主：玉米、大豆的表现及不同宿主响应侵染的转录组，寻找导致宿主特异性的转录组差异，发现F. virguliforme通过转录可塑性调控其致病宿主范围。本研究对于调节致病性与内生性生活方式的潜在转录过程的比较，将为植物致病真菌侵染宿主植物的机制提供新的见解。
论文ID
原名：Fusariumvirguliforme Transcriptional Plasticity Is Revealed by Host Colonization of Corn vs Soybean
译名：镰刀菌Fusarium virguliforme在玉米和大豆的定殖差异与转录可塑性相关
期刊：Plant cell
IF：8.631
发表时间：2019.12.17
通讯作者：Brad Day
通讯作者单位：密歇根州立大学
DOI号：10.1105/tpc.19.00697
实验设计
首先利用第三代PacBio单分子测序技术对镰刀菌Fusariumvirguliforme进行重测序，利用比较基因组学技术进行分析以得到高质量的参考基因组。利用F. virguliforme无性大孢子喷洒到玉米及大豆幼苗的根部，接种后0、2、4、7、10和14 d（DPI）记录植物生长及发病症状并取样，同时将体外萌发的孢子及以上样本提取RNA，进行转录组测序，分析不同时间及宿主的差异表达基因、GO通路及基因共表达网络。
结果
1 镰刀菌Fusariumvirguliforme高度连续参考基因组的生成
绘制F. virguliforme基因组得到了高质量的参考基因组，包含52 MB与96个重叠群，N50为1.54 MB，所得的基因组大小略大于之前的版本1（v1），同时邻接度和N50得到了显着改善。两个基因组版本之间的同义性高度分散（图1A），在同线区内两个基因组之间的微共线性是高度保守的（图1B）。在版本1（v2）中注释了2889个在v1中丢失的新基因，基因组注释的完整性达到98%。进一步探索基因组，发现了232个基因是候选效应子及365个碳水化合物代谢相关基因。
图1.镰刀Fusariumvirguliforme基因组版本之间的同线区。
（A）基因组版本1（v1）和基因组版本2（v2）的同线区域图。包括长度差异在内的对角线说明了维尔氏弗氏杆菌v1和v2基因组版本之间的重叠距离，以及每一个中支架（Sca）和重叠群（Ctg）之间的同源区域。
（B）基因组v1的支架1和基因组v2的重叠群1通过阴影灰色区域相连的微共线性。包含基因的区域分别以绿色或蓝色突出显示，分别表示正向或反向。
2 在玉米和大豆上F. virguliforme侵染产生根的不同表型
玉米和大豆接种F. virguliforme，分析其表型发现两周后大豆主根和下胚轴区域均显示出坏死迹象（图2A）。另外，真菌引起的根坏死已经扩散到与主根相邻的侧根。这种症状的发展与SDS的根部疾病进展相一致。而在玉米根部未观察到任何明显的根萎黄或坏死迹象（图2A）。
对大豆和玉米根部的真菌菌丝进行胎盘兰染色发现，尽管在两个寄主中真菌生长和定殖都很明显，但发育阶段根据寄主植物而异（图2B）。例如，接种后，在两个宿主上真菌孢子萌发，并且在接种后2天（DPI），真菌菌丝体已在根表面扩展。有趣的是，玉米根上的菌丝体与根表皮细胞平行生长，而大豆根上的菌丝体没有明显的定殖方向。另外，2 DPI时大豆根观察到圆形和肿胀的菌丝体结构，这些结构类似于穿透结构（附着胞）。在玉米上直到7 DPI才观察到这些类似侵染结构。7 DPI到14 DPI真菌在两个宿主上菌丝体的定殖增加，然而到14 DPI时，大豆根上明显出现了大型分生孢子，表明在有症状宿主上病菌已开始无性繁殖，而玉米根上却没有。在7 DPI时大豆根变色，10 DPI时坏死，表明向死体营养型的转变（图2B）。而玉米均未观察到明显的症状。
在侵染过程中选择6个时间间隔取样，同时收集了通过体外萌发而产生的大孢子样品，进行了RNA测序，比对F. virguliforme基因组v2。真菌mRNA reads在0至2 DPI时仅占总reads的0.04-0.13％（图2C）。玉米（无症状宿主）样本中真菌reads随时间推移呈线性增长，在7到14 DPI时占总读数的1.11-2.53％。但是，直到7 DPI时大豆（有症状宿主）中的真菌reads基本没有增加（图2C）。之后真菌reads的百分比与接种后玉米样品中的reads相似。在大豆中，这种增加与症状的发展以及从活体营养到死体营养的转变同时发生。
图2. Fusariumvirguliforme对大豆和玉米的致病性分析。
（A）大豆和玉米接种后14 d的植物生长和发育。
（B）大豆cv. Sloan和玉米cv. E13022S接种F. virguliforme和对照为的胎盘兰染色。箭头指向真菌生长和发育的区域。星号突出显示类似附着胞的结构。DPI，接种后数天。
（C）利用F. virguliforme参考基因组v2比对得到的RNA序列的百分比。每个样品用彩色圆点表示，线代表3个生物学重复的平均值。
3 宿主诱导的Fusariumvirguliforme基因表达谱
对来自玉米和大豆的所有39个样品以及萌发的大孢子样品进行了主坐标分析（PCA），结果显示根据寄主和时间的差异，所有样品在该组中都明显分开。最大的区别是在4到14 DPI之间，表明植物与真菌的互作极大影响了F. virguliforme基因的表达。
将F. virguliforme在大豆或玉米侵染过程中的基因表达模式与体外萌发过程进行比较，发现侵染大豆和玉米的真菌样品中分别有4192个和4072个F. virguliforme的差异基因表达上调（log2差异倍数> 1），其中3171和3010个基因上调倍数大于2。在大豆样本中F. virguliforme显着上调的基因绝大多数在0、7、10和14 DPI（图3A），而玉米样本中的大多数差异基因来自7、10和14 DPI（图3B）。出乎意料的是，虽然在0 DPI时玉米样品中的读取深度比大豆样品中的读取深度要少，但检测到另外127个基因显着上调（log2差异倍数> 2），表明病菌对玉米响应升高。差异基因上调的最大变化发生在玉米的4-7 DPI和大豆的10-14 DPI，其中只有3个基因是保守的，其中Fvm1_12746被注释为膦酰基丙酮酸脱羧酶，与真菌有机酸合成相关。
GO富集分析发现相关差异基因涉及50多个代谢途径，包括羧酸、脂质或辅因子的生物合成、多糖代谢、蛋白质去磷酸化和小分子生物合成（图3C和D）。
图3.在大豆和玉米寄主中与在大孢子萌发过程中的F. virguliforme基因的时间表达模式。
（A）和（B）：大豆（A）或玉米（B）寄主根与大孢子萌发过程中的差异表达的基因数量（DE，log2（FC）> 2）
（C）和（D）：大豆（n = 233）（C）或玉米（n = 165）（D）定殖过程中F. virguliforme显着上调的（log2（FC）> 2）基因聚类按照时间点分布的热图。
4 在F. virguliforme宿主定殖过程中基因共表达时间差异
对数据进行加权基因相关网络分析，根据其时间模式将模块分为四个大组：1）2 DPI早期诱导表达，但在4 DPI下调。 2）4-7 DPI时表达升高； 3）7-10 DPI被诱导表达； 4）2-4 DPI表达水平下调，但10 DPI时被诱导（图4）。时间模式看起来相似，但是不同宿主基因富集差异很大。
第1组中的F. virguliforme-玉米相互作用网络中的基因共表达模块在许多功能过程的推定负调控过程富集，包括细胞代谢、大分子合成和初级代谢。这表明F. virguliforme在与玉米根的早期相互作用时间抑制次生代谢并利用自身能量。但是，在大豆侵染2 DPI样本中上调的过程富集在活性氧和草酸合成，都与定殖过程中早期活体营养和死体营养的植物真菌互作有关。真菌菌丝中的活性氧参与细胞分化为侵染结构（如附着胞），2 DPI时在大豆根部出现了类似附着胞的结构（图2B），这表明F. virguliforme已经在接触后48小时内穿透宿主组织。草酸生物合成基因富集表明真菌可能通过自噬下调宿主细胞死亡，以防止宿主大规模的坏死反应。综上所述，这些分析表明，F. virguliforme在2 DPI开始已经侵染并参与了大豆寄主的反应。
在玉米和大豆接种了F. virguliforme后，许多共表达模块均在4-7 DPI上调，且大多数在其余定殖过程中也表达增加（图4A），其相关的代谢过程见表1。与宿主防御相关的过程富集。例如，在4 DPI时，与羧酸生物合成相关的基因和相关过程被上调，表明正在产生毒素。在大豆中表现为更快的定殖过程，其中与纤维素、果胶和多糖相关的细胞分解代谢过程富集。4 DPI时观察到小分子生物合成基因富集，与F. virguliforme-大豆互作的表型联系，表明其可能与坏死性效应子功能相关。总的来说，这些观察结果突出了从活体营养型向死体营养型生活方式的最初转变，同时伴随着宿主组织的改变和分解，使之进一步增殖。
在F. virguliforme-玉米样品中，7-10 DPI上调的模块中基因富集在许多不同的过程。其中，NADP的上调表现突出，这7 DPI时侵染结构的分化起始相关（图2B）。与氨基酸糖的分解代谢有关的基因上调也暗示了接近植物衍生的化合物的途径，很可能是通过真菌直接穿透宿主组织。同时化学刺激相关途径的上调可能表明F. virguliforme正在感知宿主防御反应包括产生和分泌抗菌化合物。在F. virguliforme在玉米中激活获取营养的相关途径时， F. virguliforme在大豆中激活的是保护相关途径，包括抗生素分解代谢、对ROS的响应和对宿主防御的化学物质。
14 DPI时与第4组相关的过程（图4）表现了宿主定殖的功能。例如，在源自玉米的样品中诱导了主要涉及氨基酸、糖和硝酸盐获取的途径。然而，在同一时间点，大豆样品中开始出现了死体营养型，涉及途径包括：细胞杀伤有机酸转运以及通过细胞氧化还原稳态抵抗宿主诱导的ROS的自我保护相关途径（图2B）。
在两个宿主定殖过程中富集的途径在时间上保守性较差，这表明了F. virguliforme转录组的可塑性。总之在这两个宿主之间进行比较时，很少有基因以类似的方式在模块内共表达（图5）。此外，在接种F. virguliforme的大豆和玉米的共表达网络之间只有8％的基因保守。
图4.宿主诱导的F. virguliforme响应基因的不同基因共表达群。
（A）和（B）：在整个时间过程中，F. virguliforme在玉米（A）或大豆（B）根部定殖期间，基因共表达模块的时间表达谱。模块被分为四个不同的表达模式：1）在2 DPI上调； 2）在4-7 DPI上调； 3）在7-10 DPI下调； 4）在10-14 DPI上调。
图5.有症状和无症状寄主揭示了F. virguliforme定殖过程中的转录组可塑性。
加权基因表达网络分析模块中重叠基因的百分比计算方法为：每个宿主上F. virguliforme表达之间共同基因的数目除以模块中包含最少基因数量的基因总数。模块使用分组分配进行注释，如图4所示。蓝色阴影增加表示两个模块之间共同的基因的百分比增加。
5 根定殖过程中特定宿主的基因表达模式
比较每个时间点来自不同宿主的F. virguliforme基因表达（图6A）。发现大多数基因（81％；9,002）在不同物种定殖中没有差异。在差异诱导的基因中，只在玉米根定殖期间上调43％（924个基因），只在大豆定殖时上调56％（1,186个基因）。在这些差异诱导基因中，绝大多数在10-14 DPI诱导。尽管在早期时间点差异表达上调的基因较少，但这些基因显示了真菌定殖在不同时间阶段的特定过程。有趣的是，在0 DPI定殖于大豆根的F. virguliforme高度上调的基因（log2倍变化> 20）与DNA甲基化有关，表明该过程是由大豆根中的宿主信号诱导的。在0 DPI的玉米根定殖过程中，没有富集到生物学途径。看起来镰刀菌在玉米根部2 DPI开始，通过上调ABC转运蛋白并通过使用萜烯合酶来初始化毒素分泌，响应宿主诱导的抗菌代谢物。通过大豆定殖2 DPI的独特的上调基因显示，镰刀菌通过活性氧的产生和Zn(II)-Cys6真菌转录因子的下调穿透大豆根部。
大约4 DPI，大豆根的镰刀菌定殖导致明显真菌防御信号的激活，如各种细胞色素氧化酶基因的快速而强烈的诱导（log2倍数变化> 10）。有趣的是，这些基因在玉米定殖的样品中没有同时上调，这表明真菌没有穿透根部，和/或缺乏抗菌代谢物的积累。但是，在7 DPI时，玉米样品中细胞色素氧化酶和NADP上调，表明菌丝穿透结构的分化。同时，在F. virguliforme大豆样品中，细胞降解和与养分获取相关的过程显着上调（Log2倍变化> 10），如糖苷水解酶和果胶酶以及各种养分转运蛋白的表达。在10-14 DPI，差异基因更多，其中玉米样品显示出与分泌和分解代谢过程相关的基因丰富，而大豆样品则是真菌生长的过程转变（例如甘油脂和脂蛋白的生物合成）。与观察到大豆根部在14 DPI时无性繁殖的情况相符（即图2B）。
在F. virguliforme侵染期间宿主落叶的关键是病原体产生的蛋白质性植物毒素的分泌，导致宿主叶片SDS症状的发展。在这项研究中，涉及毒素和分泌蛋白产生的基因表达水平以时间依赖性方式被诱导（图6B和C）。此外，虽然大豆样本中有大约3倍的预测效应子编码基因均在0-2 DPI上调，但在这些时间点预测的效应子编码基因并没有上调。而在4 DPI，在大豆根中4倍的候选效应子上调，包括那些具有与果胶裂解酶、糖苷水解酶和坏死诱导蛋白相关的预测功能域的候选效应子。但是，F. virguliforme侵染玉米除3个基因外，其他基因均未差异表达。此时，两个宿主中以相似的模式诱导了候选CAZymes表达，并且在0、2和4 DPI时未检测到差异表达的CAZymes基因。但是，对于4 DPI，大豆根中的F. virguliforme裂解酶和糖苷水解酶中的表达水平要高得多（> 10 log2）。这种趋势在7 DPI时更为严重，在F. virguliforme侵染的大豆根中，许多与果胶裂解酶相关的CAZyme和效应子被上调。这表明在7 DPI时玉米和大豆之间的真菌定殖出现差异，这可能是由活体营养型向死体营养型的转变，因为可见症状开始于7 DPI时。明显的死体营养型在大豆根部10和14 DPI，具有14和28个候选效应子以及37和114个候选CAZyme，用于对大豆根进行细胞分解。相反，在玉米根定殖过程中很少表达果胶裂解酶。研究者认为，裂解酶表达的降低可能源于玉米和大豆之间的基本生理差异，单子叶植物的根只含有10％的果胶，而双子叶植物的含有量高达30％。
讨论
系统的比较致病及非致病的真菌能够更好的鉴定与致病性和宿主-病原体互作的遗传标记。本文基于高分辨率转录组来解析病原真菌侵染过程，及基于宿主防御过程进行有症状或无症状的定殖。为实现此目的，本文组装并注释了F. virguliforme新基因组，在体外和植物中利用39个mRNA转录组数据鉴定两个宿主（有症状大豆宿主和无症状玉米宿主）之间的侵染过程。玉米根保持无症状，而大豆根褪绿并最终坏死，导致表型差异的是依赖宿主的转录过程差异。
共表达模块基因富集显示，F. virguliforme定殖玉米根部过程中，基因转录动态在整个过程中是逐渐变化的；相反，大豆定殖过程在4-10 DPI时转录水平显着变化，包括小分子分泌和宿主细胞死亡过程的信号传导相关基因。这与先前描述的半活体寄生的植物病原菌转录动态一致。同时，病原真菌对植物质膜定位蛋白的去磷酸化被认为是防止刺激宿主防御反应的信号级联的关键过程。总体而言，大豆定殖过程中F. virguliforme相关途径基因的上调表明，与定殖于玉米根部相比，这种策略可以降低宿主的免疫反应。
有趣的是，在转录组中鉴定出的差异似乎不是不同宿主特异性基因表达的结果，而是基因在宿主定殖过程中时间诱导的结果。基因共表达网络显示宿主特异的侵染时间与病原体获取营养源的途径发生变化相关。大豆根部2 DPI表明对宿主表面的快速识别和早期侵染的开始。然而，玉米根部早期侵染过程中对生物学过程和初级代谢产生负调控，表明真菌没有立即侵染玉米并导致其免疫过程。直到7 DPI才出现玉米侵染相关基因的上调，而大豆中发生在2DPI，这说明玉米对真菌的识别被延迟了。
当F. virguliforme侵染玉米根部时（约7 DPI），大豆的侵染已经开始从活体寄生转变为死体营养型侵染。小蛋白分泌和真菌毒素产生相关基因的上调证明大豆根部镰刀菌对宿主细胞进行了修饰，这些是与营养获取相关的关键及必需途径。在整个侵染过程中，大豆样本中与细胞死亡和致病性相关的基因表达普遍增加，相反，在玉米中，较少的分解代谢过程相关基因表达，表明与营养获取相关的途径普遍降低。因此推测F. virguliforme与两个宿主的相互作用的比较分析支持了这种真菌的转录组差异的假设。不同的宿主上真菌生物学途径相关基因的诱导在时间上却是不同的，这也与之前研究一致。
本研究为鉴定大豆坏死关键致病过程提供了独特的视角。例如，先前的分析认为4 DPI时效应子和CAZymes的基因的上调表明从活体营养向死体营养型转变的开始。本研究也观察到与玉米相比，大豆中与CAZyme和果胶裂解酶相关的基因表达增加，而且随着时间的推移，坏死诱导蛋白的表达明显上调，提示可能存在双子叶植物特异性反应。在大豆侵染中，真菌效应子和CAZymes在第2、4和7 DPI中表达逐渐增加，但在玉米中却没有。总体而言，这些表达模式与之前研究数据吻合，进一步支持了以下假设：细胞降解和坏死诱导肽的上调是从活体营养向死体营养型转变的关键步骤。
虽然大豆出现了半活体营养侵染过程，但是在F. virguliforme侵染玉米时侵染被延迟且分解代谢活性较低。缺乏对宿主的识别机制或PTI导致的宿主防御机制上调会减慢真菌的生长并下调发育。在侵染玉米后较少的效应子和CAZymes表达且下调，表明玉米根内的细胞环境并未刺激坏死诱导肽的大量上调。这可能源于单子叶植物和双子叶植物之间细胞结构的生理差异。
活体营养向死体营养型转变的过程及其调控机制尚不清楚，推测转录因子可能发挥关键作用，大量文献证明Zn(II)-Cys6和C2H2锌指家族的转录因子成员影响致病及生长发育。本研究发现几个Zn(II)-Cys6基因在大豆早期定殖过程中特异性上调，可能导致F. virguliforme对大豆的致病性增强。而几个关键过程，例如果胶裂解酶生物合成基因和真菌毒素生物合成基因的转录调控，与活体营养向死体营养型转变特别相关，而这些途径在玉米中显著降低。
本研究重点分析了真菌在多个宿主上的转录可塑性，结果表明在宿主-病原互作期间转录调控的重要性，尤其在不同症状表型间随时间推移的差异。本表明了F. virguliforme在农业生态系统内两个不同生态位：一个生态位是在没有合适宿主的情况下支持病原菌的维持和生存，另一个则是支持病原菌繁殖和扩散，导致重要作物的产量大幅下降。F. virguliforme在这两个不同角色中发挥功能的能力表明，需要考虑植物病原菌基因组表达差异转录程序的能力，这反过来又赋予了广泛宿主的生活方式可塑性。
评论
镰刀菌是常见的土壤习居菌，寄主范围广泛，有些导致重要的植物真菌病害，如小麦赤霉病的禾谷镰孢等。Fusarium virguliforme侵染大豆根部引发大豆猝死综合症，但是在玉米上则为内生菌不能导致明显明显症状。本文通过对其高质量参考基因组的测序，利用转录组测序分析了在有症状的大豆、无症状的玉米及体外大孢子萌发过程中多个时间点的基因表达谱，发现在定殖不同宿主时平均基因共表达模块重叠率低于8％，表明病原真菌的转录转录可塑性是宿主差异表型的基础，同时筛选得到的侵染相关差异基因为进一步解析病原真菌致病机制提供了重要数据支持。
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