编译：小北，编辑：十九、江舜尧。
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导读
肝脏在机体免疫防御和免疫耐受中发挥重要作用。肝脏上的免疫细胞(LrICs)决定免疫特性，但是这些细胞独特的组成和异质性尚未完全掌握。本研究研究者通过利用scRNA-seq绘制综合的转录图谱将多样的LrICs进行分离。从配对肝脏灌注、脾以及外周血中绘制了共计70,706个CD45+的免疫细胞，确定了30多个不同的细胞群体，其中有13个T和NK细胞、7个B细胞、4个浆细胞以及8个髓细胞，描述了它们的组织分布、基因表达以及功能元件。特别的是，有四个CXCR6+ T细胞和NK细胞亚群更易出现在肝脏中，这一区域是证明异质性、不同的功能以及显著的体内平衡增生的场所。研究者提出了一个基于不同趋化因子受体T细胞和NK细胞通用的系统，并通过表型、转录因子和功能进一步验证。同时通过脾脏和肝脏衍生的单核细胞和巨噬细胞群体确定了适应性改变。最终，研究者全面窥视了人类脾脏和脏脏中B细胞和浆细胞亚群，揭示了人类LrICs中的异质性和功能多样性。这篇研究展现了LrICs的综合蓝图，这将帮助研究人类不同疾病中LrICs的功能。原名：Single-cell RNA sequencing reveals the heterogeneity of liver-resident immune cells in human
译名：单细胞RNA测序揭示了人类肝脏免疫细胞的异质性
期刊：Cell Discovery
影响因子：4.6
发表时间：2020年4月28日
作者： 张政
单位： 深圳第三人民医院
DOI：10.1038/s41421-020-0157-z. eCollection 2020.
肝脏是人类最大的实体器官，介于消化系统和循环系统之间。包括蛋白质的合成和氨基酸代谢、碳水化合物、脂质和维生素等肝脏重要的功能。从免疫学上，肝脏不仅对于检测体循环中外源性病原体和抗原负责，同时对保护宿主细胞免受膳食、药物、内脏细菌产物中的抗原促进免疫耐受。保持肝脏双重免疫特性的潜在机制尚不明确。分析肝脏免疫细胞的独特环境和功能，对于理解肝脏特异的免疫学特性以及肝脏疾病中的免疫调节事件是非常重要的。肝脏免疫细胞是异质性的并且由不同免疫功能的多个亚群构成，不仅包括传统的T细胞、B细胞、NK细胞和单核细胞，近期的报道指出还包括LrT细胞、LrNK细胞和巨噬细胞，在循环中表现出显著的差异。这些LrICs同样受组织微环境的影响，环境中的调节因子可能在多个肝脏疾病中发挥重要作用。然而，这些研究通过经典的流式实验聚焦于特定的细胞亚群或者有限的标记物数量，对于人类肝脏中免疫细胞的构成和异质性尚未进行全面的描述。在单细胞水平对人类肝脏免疫细胞进行图谱绘制对于理解免疫的病理过程以及肝脏的治疗是非常重要的，但是尚未确定。近期scRNA-seq技术的发展适用于解决免疫细胞内的复杂性和异质性，确定新的细胞亚群、DEGs以及信号通路，并且解释细胞种系之间的关系。尽管scRNA-seq已经应用于剖析健康人类和小鼠整个肝脏中的外周血单核细胞（PBMCs）、NK细胞、树突状细胞(DCs)以及先天性淋巴样细胞(ILCs)，对于健康捐赠者肝脏免疫细胞的整个图谱尚未有评价。之前的研究也受限于检测的所有免疫细胞的数量，以及没有可比对的血细胞进行比较。因此，之前的研究并没有描绘出高分辨率的肝脏免疫细胞图谱、LrICs也没有完全确认。脾脏是最大的免疫器官。解剖学上而言，脾脏静脉血通过门静脉汇入肝脏中，因此成对脾和血液是描述LrICs的最佳对照。本研究中，研究者利用scRNA-seq对肝脏移植捐赠者成对脾和PBMCs的肝脏内CD45+免疫细胞进行了首次无差别的综合图谱分析，这个图谱将是未来研究对人类肝脏、脾脏和多个肝脏疾病中免疫亚群作用的重要资源。研究者对三个捐赠者配对肝脏灌注（LP）、脾脏和PB正常组织的CD45+细胞进行scRNA-seq分析。简而言之，通过磁选从新鲜样本中分离到活CD45+免疫细胞，利用10×Genomics平台获取单细胞转录组（图1a）。最终的资料组包括从血、脾脏和LP三重复样本中获取的70,706个订单细胞转录组，单细胞图谱的结果经过严格的高质量过滤，每个细胞中平均reads为61,000，中位基因为1,304，UMI值为4,213。研究者利用离散获得的高度突变基因进行PCA分析，随后研究者利用开始50PC的负荷量作为input进行UMAP可视化分析同时用柱形图进行细胞富集。在四个主要的细胞亚型NK细胞、T细胞、B细胞和髓细胞和浆细胞（PC）分为23个不同的细胞集簇（图1b），每种细胞由它们特异的显著基因CD3D (T细胞标记物)、KLRF1 (NKp80, NK细胞标记物)、CD19 (B细胞标记物)、SDC1 (CD138, PC细胞标记物)、CD14 (单核白血球标记物)以及FCGR3A (CD16)进行确定（图1c）。研究者将数据集成消除了剩余的批处理效应，并使结果在不同的捐赠者中再现。图1单细胞转录组确定人类肝脏中不同的免疫细胞和特异的标记物因此无偏差的scRNA-seq数据能够比较在LP、脾脏和血液中细胞构成的分布。结果显示在LP中T细胞和NK细胞有较高的比例，在脾脏和血液髓细胞中B细胞具有较高的比例（图1d、e）。这些数据提示免疫细胞构成的良好结构在这些组织中显著不同并且确定再现了整个免疫细胞图谱。研究者进一步确定了肝脏衍生的淋巴细胞的特异性特征。与脾脏和血液中相比研究者绘制了四个免疫亚群中肝脏特异的基因，结果发现7个基因高表达。重要的是，一个调节锌和铜稳态的金属结合蛋白金属硫因（MT）的表达在LP中显著高于在脾脏和血液中（图1f）。在这些MTs中，MT2A和MT1X表达最高（图1g），研究者进一步通过qRT-PCR在mRNA水平进一步验证（图1h）。同时发现细胞毒性分子GZMA和NKG7、趋化因子CCL4、KLRB1 (CD161)、IER2在肝脏衍生的淋巴细胞中高表达。这些分子与肝脏衍生的细胞亚群特异性相关，可能参与形成人类肝脏特异的免疫微环境。尽管联合分析展现了免疫细胞图谱的整体，大数据分析可能在细节上掩盖了每个主要免疫细胞亚群的亚聚类。因此研究者基于表达变化基因第一次全面剖析了T细胞和NK细胞。结果发现4个CD4+T细胞、7个CD8+T细胞、2个NK细胞、1个ILCs和1个增殖细胞。并且基于典型标记物的表达和特异分布利用UMAP进行可视化分析（图2a、b）。C1和C5确定了CM CD4+和CD8+ T细胞，C2和C6确定了循环中的CD4+和CD8+T记忆细胞，C3和C7确定了卵泡CD4+ (TFH)和CD8+ T (TFC)细胞，C4确定了调节型T细胞，C8–C10代表定位在组织上的T细胞亚群，C8确定黏膜相关不变式T细胞（MAIT），C9代表CD8+组织上的调节型T细胞，C10代表γδ T细胞，C11代表CD8+T细胞表达细胞毒性的标记物（GZMB+ CD8+ Tc），C12是组织上的TrNK亚群，C13是典型的表达细胞毒性标记物的NK亚群(GZMB+ cNK)，C14确定ILCs，C15确定了复制的T和NK细胞亚群。与血液相比，脾脏和肝脏通过多样的T和NK细胞亚群促进组织分布图谱（图2c）。研究者确定了C3(TFH)和C7 (TFC)分别更易坐落在脾脏表达囊泡CD4+和CD8+ T细胞亚群，而C8 (MAIT)、C9 (Trm)、C10 (γδ T)以及C12 (TrNK)坐落在人类肝脏中（图2c、d）。图2在人类脾脏和肝脏中组织驻留的T和NK细胞的特征为了探究Trm和TrNK细胞共有的显著特征，研究者依据之前的研究评估了CD69+Trm细胞的重要特征。这31个关键的基因包含两个基因亚群通过单细胞UMAP分析评分并可视化。研究者发现分值的特征更易与MAIT、Trm、γδ T、TrNK细胞匹配（图2e）。研究者通过与肝脏衍生的Tem以及GZMB+ CD8+ Tc细胞比较发现了Trm和TrNK细胞的独特基因簇。总共63个基因在Trm细胞中高度表达，包括趋化因子(XCL2、CCL3、CCL4)、细胞黏附分子(ICAM1、VCAM1、ITGAD)、转录因子(EOMES、IKZF2)等。同样的在MAIT细胞中的特异基因包括MAIP特异的基因(SLC4A10和KLRB1)、趋化因子受体(CXCR6、CCR5、CCR6)和转录因子(IKZF2和ZBTB16)。TrNK细胞的特异性基因在与GZMB+ cNK细胞比较后同样与MAIT和CD8+ Trm细胞比较，比较分析发现TrNK和Trm细胞的关键基因，包括KLRB1、GZMK、CD160、CXCR6、EMOES等（图2c）。最终，研究者确定这些特异的表面标记物CXCR6能够与CD69共表达，但是通过流式检测缺乏CD62L，进一步说明CXCR6+CD69+ Trm、TrNK、MAIT细胞在人类肝脏和脾脏中富集（图2g）。如图2a，C15被确定是循环的T细胞和NK细胞中表达复制的标记物，例如MK167与非循环中的T细胞和NK细胞比较。在循环中的T细胞和NK细胞中基于典型标记物的表达（图3b）确定了7个循环中的亚群（图3a）。C1-C6分别确定了循环中的Treg细胞、MAIT细胞、CD8+ Tem细胞、GZMB+ CD8+Tc细胞、TrNK和GZMB+ cNK细胞。C7的细胞是淋巴细胞亚群带有NK细胞的标记物，例如NCAM1、KLRF1和早期分化的一些标记物包括CCR7、SELL、IL7R、IL18RAP、TNFRSF18（图3b）。图3 scRNA-seq对人类脾脏和肝脏中的循环T和NK细胞的描述在血液、脾脏和LP中循环的T和NK细胞亚群的组织驻留图谱表现在UMAP图中（图3c）。外周循环的T和NK细胞不包括TrNK和MAIT细胞。相反，肝脏和脾脏中循环的T和NK细胞包含更多的TrNK和MAIT细胞（图3d）。此外，在NK、CD4+ T、CD8+T细胞中循环的TrNK、Treg、MAIT细胞的比重LP高于血液和脾脏（图3e）。FACS数据也证实肝脏中CXCR6+CD16− TrNK细胞ki67的表达水平高于CXCR6−CD16+ NK细胞，这也提示LrNK在人体中表现出更强的增殖状态（图3f）。这些发现都强调了T和NK细胞在组织上的内稳态。为了描述C7循环的特征，研究者利用GSEA分析了特征基因的转录组学特征（图3g），结果发现基因在Wnt-beta-Catenin、Myc靶向、非折叠蛋白反应以及炎症反应信号通路中富集，并且参与Wnt-beta-Catenin、Myc靶向的特定基因簇显著上调（图3h）。结合NK细胞标记物和早期分化的标记物，C7更像代表NK细胞种系或者淋巴细胞前体细胞群体。有趣的是研究者发现一些关键的趋化因子(CCR7、CXCR3、CXCR5、CXCR6、CX3CR1)具有有效确定T和NK细胞亚群的潜能（图4a），例如CCR7在naïve/CM CD4+ (C1)和CD8+ T(C5)中特异性表达。CXCR3由记忆CD4+ (C2)和CD8+ T 细胞(C6)表达。CXCR5由小泡CD4+ (C3)和CD8+ T细胞(C7)表达。CXCR6更倾向于由MAIT (C8)、CD8+ Trm (C9)、γδT (C10)、TrNK细胞(C12)表达。CX3CR1特异性的由GZMB+ CD8+ Tc (C11)和cNK细胞(C13)表达。NK& T趋化因子受体表达图谱与它们不同的组织分布相关。研究者观察到肝脏和脾脏衍生的NK & T细胞表达较高水平的CXCR6而血液T细胞主要表达CCR7（图2d）。重要的是，基于这五个趋化因子受体的特定类别系统与T和NK细胞效应分化方案相关（图4b）。CCR7定义了由MYC、LEF1、TSHZ2、MAL、NOSIP、TCF7表达确定的naive/CM的状态。CXCR3/CXCR5定义了由效应分子的表达水平确定的中间物更加分化的状态。CXCR6定义了通过EOMES、GZMK确定的驻留组织的种系，而CX3CR1定义了最终分化的状态，伴随一些细胞毒性分子FGFBP2、GZMB、GNLY、SPON2、PRF1的共表达。研究者进一步通过流式确定了趋化因子CD8+ T和NK细胞的分类。通过除去基于TCR-Vα7.2和CD161的MAIT细胞，剩余的CD8+ T细胞包含CCR7+ naïve T (Tnaïve)细胞和CCR7−记忆细胞，后者进一步划分为CXCR6+CX3CR1− Trm、CXCR6−CX3CR1+Tc以及CXCR6−CX3CR1− Tem细胞。大量的数据证实CXCR6+ CD8+ T细胞和MAIT细胞在LP中富集，然而Tnaïve细胞和Tem细胞分布在血液中（图4c）。重要的是，CD8+ T细胞的四个群体表达不同的转录因子。Tnaïve细胞缺少四个TFs，而其他记忆T细胞表达EOMES。Trm更倾向于表达EMOES、PLZF、Helios，而CX3CR1+ Tc细胞更倾向于表达T-bet。同样的，大部分坐落在肝脏中的CXCR6+ NK细胞表达高水平的EOMES和PLZF（图4d），而CX3CR1+ NK细胞只表达T-bet。研究者在功能上发现CXCR6+ LrT细胞和CXCR6+CD16− LrNK细胞具有更大的潜能在IL-12/IL-18刺激下产生IFN-γ和CD107a（图4e）。组织学上，从蛋白图谱来看，在肝脏中很少存在CCR7+细胞，GZMB+细胞也都集中在门区，而GZMK+ (Trm and TrNK)细胞分散在肝脏窦状小管并且它们的数量大大超过GZMB+细胞。研究者同样发现HBV感染的肝脏包含更多CXCR6+ LrT和LrNK细胞（图4h），这也提示LrNK & LrT细胞在HBV相关肝脏疾病中的病理作用。通过全面的分析研究者发现CXCR6标记LrT和LrNK细胞，包括MAIT、CXCR6+ CD8+ Trm细胞、γδ T细胞以及CXCR6+ TrNK 细胞，尽管它们在肝脏中的分布和功能不同。基于典型标记物的表达（图5b）UMAP确定了八个髓细胞集簇（图5a）。C1确定了经典的CD14+单核细胞，C2确定了组织衍生的CD14+亚群，该亚群主要出现在脾脏和肝脏中（图5c），C3确定了CD16+单核细胞，C4确定了巨噬细胞，C5确定了巨核细胞，C6-8确定了多样的DC亚群，分别是cDC1、cDC2、pDC，C9表达单核细胞T细胞和B细胞的标记物，这也提示存在混合的多胞胎。图5 scRNA-seq揭示人类肝脏中单核吞噬细胞的异质性驻留在组织上的髓细胞亚群同样被检测（图5c），巨核细胞仅在血液和脾脏中发现。经典的CD14+单核细胞是血液中髓细胞的主要群体，在脾脏和肝脏中降低，相反组织中的CD14+单核细胞、CD16+单核细胞和巨噬细胞在脾脏和肝脏中相对富集，但是在血液中显著缺失。DCs仅代表较小的细胞群体，但是在脾脏中的比例高于血液和肝脏中（图5d）。这些发现都说明这些驻留在组织中髓性细胞群体分布的重要性。环境因素的最好例证是TrICs，特别是髓性细胞群体中。研究者发现CD14+和CD16+单核细胞，UMAP结果显示组织衍生的细胞不同于血液中的（图5c），这也提示了转录组的差异。脾脏和肝脏中CD14+和CD16+单核细胞与血液中的CD14+和CD16+相比，GSEA发现IFN-α和IFN-γ反应、补体途径、炎症反应并且IL2-JAK-STAT5、IL6-JAK-STAT3、P53信号通路显著普遍下调（图5e、f）。这些发现都体现了一个观念：肝脏是一个免疫耐受的器官，能够限制肝脏炎症活化。最终研究者通过流式发现PB主要包含CD14+经典的单核细胞而脾脏和LP包含更多的CD16+单核细胞，特别是MerTK+和CD206+ (MRC1)单核细胞和巨噬细胞（图5g），这一结果与研究者的scRNA-seq也是一致的。总之，分析结果证实不同CD14+单核细胞、CD16+单核细胞和巨噬细胞是健康肝脏中主要富集的单核细胞亚群，它们适应独特的免疫耐受环境。集簇分析基于典型标记物的表达（图6b）利用UMAP确定了7个B细胞集簇（图6a）。C1是naïve B细胞亚群，C2是脾脏中富集的边缘带B细胞（MZB），C3表达TXNIP、COCH、SSPN以及经典的记忆B（cMBC）细胞，C4表达ITGAX并且确定年龄相关的ABCs细胞，C5确定了GCB细胞，C6高度表达ISG和ISG+B细胞，C7高度表达ZBTB32和ZBTB32+ B细胞。图6 scRNA-seq揭示了人类脾脏和肝脏中B细胞的异质性B细胞亚群的组织驻留图谱通过UMAP进行比较（图6c、d）。脾脏中包含最大数量的B细胞。Naïve B是所有组织中含有最大比例的B细胞。MZB在血液中缺失并且在脾脏中含有主要的B细胞亚群。MZB细胞同样在LP中出现。cMBC的比例在血液中和LP中相似，但是在脾脏中降低。ABC在血液、脾脏和LP中是一个不同的亚群。GCB、ISG+ B、ZBTB32+ B细胞是在脾脏和肝脏中富集的稀少群体，除了血液中小数目的 ZBTB32+ B细胞（图6c、d）。研究者同样注意到血液中的cMBC和ZBTB32+ B细胞不同于组织中（图6c），这也提示存在转录组差异。人类B细胞亚群的特异性标记物尚未有共识，为了确定主要的B细胞亚群，研究者对之前naïve、MZB、cMBC、ABC的报道进行了基因表达特征的分离并且检测了scRNA-seq定义的B细胞亚群中选择性富集的特征。的确，GSEA分析也发现上调和下调的基因都完好的与naïve、MZB、cMBC、ABC细胞匹配，这也揭示了人类B细胞群体的异质性（图6e）。GCB、ISG+ B、ZBTB32+ B细胞的GSEA同样验证了它们特异的功能（图6f）。GCB的GSEA发现包括Myc靶向通路和TNF信号通路、凋亡和炎症信号通路中的关键基因同样富集。的确，研究者证实了GCB细胞总Myc靶向基因的高表达（图6g）。ISG+ B细胞的GSEA也显示IFNα和IFNγ应答反应的富集（图6f、g）。ZBTB32+ B细胞的GSEA分析发现在有丝分裂纺锤体、G2M检验点和E2F靶向中富集（图6f），这也提示存在一群增殖中的B细胞。图7 单细胞方法绘制人类B细胞和ASC细胞的分化转录图谱基于典型基因的表达（图7a）UMAP可视化确定了PC的四个群体、ASC集簇（图7a）：C1作为PBs，C2作为PCs，C3和C4是具有独特转录组特征的PC集簇。C3的GSEA分析发现在非折叠蛋白反应和蛋白分泌信号通路中富集（图7b、c），这也提示存在一活化的抗体形成群体，而C4的GSEA分析发现在IFNα 应答和炎症反应的信号通路中富集，这提示体内存在细胞因子刺激的群体（图7b、c）。ASC集簇在血液、脾脏和LP中的分布与1/3的成浆细胞类似，然而免疫活化的C4仅在组织中驻留（图7d、e）。研究者比较了B和ASCs转录组来探究决定ASC分化的关键基因。依据UMI和基因数ASCs处于一个活化的代谢状态。在PBs中20%、PCs中50%的基因是免疫球蛋白基因，这也提示它们是专门的抗体制造者。除去免疫球蛋白基因，PCA分析确定了原理B细胞亚群的四个ASC亚群，提示ASCs除了高表达水平的免疫球蛋白，也具有特异的转录组特征（图7f）。BCL11A和PAX5在B细胞中表达但是在ASCs中不表达。相反，PRDM1和IRF4更倾向于在ASCs中表达（图7g）。在ASC-和B细胞相关的DEGs的进一步分析确定了1190个基因在ASCs中富集，有55个基因在B细胞中富集，这也与它们特异的免疫功能相关。表格中列举了B细胞和ASCs中的特异标记物，例如B细胞中的MHC class II分子、MS4A1、CD79B以及ASCs中的TNFRSF17、CD38、XBP1。ASC中的基因特征提示它们在抗体生成中的活性，由于大部分在ASCs中高度表达的基因与蛋白翻译、修饰以及转换密切相关（图7h）。总而言之，研究者让我们对人类不同疾病中B细胞和ASC亚群得以一窥。研究者在单细胞水平对LrICs的转录图谱研究为理解肝脏免疫反应提供了基础框架并且为基于免疫细胞诊断治疗方法的发展提供了有力的证据，特别是在肝脏疾病中。成对LP、脾脏和血液的应用进一步确定免疫细胞的亚群和标记物、比较器官内和器官外免疫功能突变的潜能、确定分化的信号通路等扩展方向。
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