科研 | Journal of the American Society of Nephrology：小鼠肾小球单细胞转录组图谱
编译：不二，编辑：十九、江舜尧。
原创微文，欢迎转发转载。
背景：肾小球是由三种不同的细胞组成，它们分别是系膜细胞、内皮细胞和足细胞。然而，健康肾小球细胞群体中存在的细胞异质性仍是未知的。方法：研究者使用基于纳米液滴的单细胞测序来检测野生型小鼠肾小球细胞。结果：近13000个单细胞转录组数据的聚类，鉴定了三种已知的肾小球细胞类型。本研究提供了肾小球细胞中基因表达的在线综合数据库，可以在数据库中查询和可视化这些数据。从人类蛋白数据库获得的免疫组织化学图谱验证了所有肾小球细胞类型的新型标记基因。细胞亚群研究显示一个内皮细胞亚群表达与内皮增殖相关的标记基因。相比之下，足细胞群体显得更均一，但包含三个较小的未报道的亚群。结论：本研究全面鉴定了单个肾小球细胞中的基因表达，并在单细胞水平为解剖健康和疾病的肾小球奠定了基础。
论文ID
原名：A Single-Cell Transcriptome Atlas of the Mouse Glomerulus
译名：小鼠肾小球单细胞转录组图谱
期刊：Journal of the American Society of Nephrology
IF：8.547（一区）
发表时间：2018年
通讯作者：Christine Kocks 和 Roman-Ulrich Müller
通讯作者单位：德国马克斯·德尔布吕克分子医学研究中心柏林医学系统生物学研究所和德国科隆大学分子医学中心
DOI号：doi.org/10.1681/ASN.2018030238
实验设计
对8周龄的野生型CD1雄性小鼠进行肾小球分离并制备单细胞悬液。通过Drop-seq进行高通量的单细胞测序分析。该方法主要检测具有ployA尾的mRNA以及长非编码RNA分子。对单细胞数据进行质控，并使用Drop-seq tools（v.1.12）对基因进行定量，然后使用Seurat进行进一步分析。利用Seurat的FindAllMarkers功能进行标记基因鉴定，以人类蛋白数据库的图谱进行比较。使用亲和纯化的兔抗在Nphs2-Cre/mTmG报告系统小鼠的肾小球上进行了免疫荧光染色。使用共聚焦显微镜获得图像。原始数据和处理后的数据可从Gene Expression Omnibus数据库（GSE111107）获得。
结果
图1A显示了本研究设计流程。研究者通过磁珠分离肾小球，然后对磁珠进行分离和洗涤，通过酶消化制成单细胞悬液，并使用Drop-seq方法进行单细胞RNA测序。从四个独立的生物学重复（每个重复包含两只小鼠）中，获得了总共14722个细胞，细胞表达超过250个基因和350个转录本（使用唯一分子标识（UMI）定义）。检测到的基因和转录本数量的中位数相似。基于泊松分布的Drop-seq方法受限于稀释作用，因此会产生doublet（一个液滴或一个微孔中包含了2个或多个细胞），大约占所用细胞浓度的10％。为了获得高质量的单细胞数据，研究者使用了以前开发的算法对特定细胞类型标记基因进行评分，并删除了1768个可能的doublets。最终的数据包含了12954个细胞，每个细胞的基因和唯一分子标识数量中位数分别为630个和950个，测序深度约为每个细胞9400个读数。
如图1B所示，剩余的12954个单细胞的聚类鉴定了五个主要细胞群。根据标记基因，其中三个对应于已知的肾小球细胞群：足细胞（80％）、系膜细胞（2％）和内皮细胞（12％）。其他两个细胞群对应于肾小管细胞（6％）和一小部分免疫细胞（0.2％）。标记基因在特定肾小球细胞类型中特异性表达（图1C和1D）。来自所有样本重复和细胞类型的分层聚类表明，根据细胞类型具有高度相关性，而与样本重复无关。为了质控单细胞制备的效果，研究者又将单细胞RNAseq数据与肾小球解离成单细胞之前和之后的polyA-RNAseq数据（分别为bulk1和bulk2）进行了比较（图1A）。尽管单细胞数据显示与两个批次mRNAseq数据呈良好相关性，但很明显的是单细胞解离会影响特定细胞类型的丰度，这说明足细胞相对于内皮细胞和系膜细胞代表性更高（图1B）。作者还将已报道的以肾小球细胞谱系示踪而分选的细胞的mRNAseq数据，与本研究分类的细胞群体数据进行了比较，结果显示本研究的分类结果与已报道结果一致。
图1 单细胞RNA测序鉴定的肾小球细胞群体。
为了评估细胞群体类型之间新型特定细胞标记基因，研究者更详细地鉴定了肾小球细胞类型。结果显示了内皮细胞、系膜细胞和足细胞的特定细胞标记基因，以及已报道的各自细胞类型相关的基因，结果也验证了聚类分析的正确性（图2A）。重要的是，以前报道的几个关键足细胞基因的表达似乎并不仅仅局限于足细胞，这一发现为今后对于此类基因在肾脏中的功能研究具有重要意义。例如，Podxl（已报道在内皮细胞中表达）、Actn4和Itgb1基因（图2）。因此，作者揭示了所有三种肾小球细胞的新型特定细胞标记基因（图2B）。通过与人类蛋白数据库获得的免疫组化染色图谱对比，在蛋白质水平上证实了大部分这些标记基因的正确性（图2B）。新型标记基因拥有广泛的分子功能，包括对内皮细胞特异表达的转录因子Meis2、疾病基因Pde3a（常染色体显性遗传高血压基因，系膜细胞特异表达的基因）以及新的足细胞标记基因E3-泛素连接酶Wsb2。综上所述，作者在转录组水平上提供了肾小球细胞类型的详细和全面的表达谱，包括已报道和新型特定细胞标记基因。
图2 单细胞转录组学揭示了肾小球细胞的新型标记基因。
到目前为止，大部分研究几乎都在整个肾小球中而不是在单个细胞中检查了基因的表达。因此，对于三种肾小球细胞类型中是否存在细胞异质性尚不明确。为了解决这个长期存在的问题，作者将包含大多数细胞的两个较大细胞群体-足细胞和内皮细胞亚群化。内皮细胞显示了五个不同的亚群（图3A）。由于高水平的足细胞标记基因表达，细胞亚群4被鉴定为残留的双细胞（图3B），在进一步分析中将其排除。其余四个亚群在所有重复中都具有相同的代表性。如图3B和3C所示，特定关键基因的表达区分了这些亚群。有趣的是，亚群3是由涉及对生理和病理的关键内皮分子反应标记基因区分的，例如内皮细胞对周细胞的作用（Jag1）、血管生成的调控（Fbln5）、内皮细胞的激活（Cxcl1）和对补体激活的反应（Cldn5）。Ehd3基因是一个已报道肾小球内皮细胞的标记基因，其表达不均匀，在细胞亚群0和2中高表达，而在亚群1和3中低表达，这表明内皮细胞中一部分Ehd3阴性细胞起源于肾脏其他部位。为了更好地了解内皮细胞亚群，作者进行了信号通路和基因集分散分析。共鉴定出四个基因集，这些基因集在不同程度上与细胞粘附、细胞成熟、应激反应和细胞增殖有关（图3D），这表明内皮细胞亚群可能代表内皮细胞生物学稳态和激活的不同状态。有趣的是，在人类蛋白图谱中，由细胞亚群鉴定的基因编码的某些蛋白（例如Fbln2、Hspa1b、S100a4和Thbd）免疫组化染色（图3B）与这些基因在人肾小球内皮细胞中的表达模式不一致。这种状态是取决于单个细胞在健康毛细血管中的定位还是仅反映肾脏其他部位的定位，还需要进一步研究。
图3 细胞亚群化揭示了内皮细胞亚群的存在。
足细胞的亚群化分析产生了七个亚群。亚群4显示了广泛的应激反应基因表达特征，组织解离引起的基因表达变化可以解释这一现象。因此，与解离前的完整肾小球测序数据相比，作者发现从解离后的肾小球细胞获得的mRNAseq数据中应激反应基因的表达增加。去除这些应激反应基因后，足细胞的聚类鉴定了6个细胞亚群（图4A），并且所有生物重复均相同。其中3个小的细胞亚群（亚群3–5）与压力响应无关（图4A），标记基因分析仅识别了少数基因，包括Cald1和Lars2基因，以及小鼠编码特异性microRNA（Gm10801和Gm10800）和非编码RNA（Gm15564和Gm23935）（图4B和4C）。而其余3个较大的细胞亚群没有特定的标记基因。由于细胞亚群中的编码转录本数量较少，因此信号通路和基因集分散分析没有产生显著的结果。
为了在蛋白质水平上验证足细胞亚群的标记基因，作者对肾小球荧光报告系统小鼠的Cald1和Lars2基因进行了免疫荧光染色，其中足细胞以绿色荧光蛋白标记。Cald1和Lars2与绿色荧光蛋白的共定位仅发生在足细胞的一部分细胞亚群中（图4D），这表明健康肾小球中足细胞之间可能存在异质性。Cald1是一种钙调蛋白和肌动蛋白的结合蛋白，已被证明在足细胞中具有糖皮质激素反应性，据推测它在糖尿病性肾病中发挥作用。Lars2是一种线粒体亮氨酸转移RNA合成酶，它在Perrault综合征中发生了突变。尽管Perrault综合征主要是神经系统疾病，但线粒体亮氨酸转移RNA的突变是线粒体脑病、乳酸性酸中毒、中风样发作综合征（MELAS）和遗传性FSGS的基础，再次表明其在足细胞中的作用。
图4 细胞亚群化显示了足细胞有限的异质性。
讨论
首先，作者观察到了单细胞解离过程的影响。单细胞数据与普通转录组数据的比较表明，足细胞相对于内皮细胞和系膜细胞数量更多，并且其中一个足细胞亚群具有应激反应特征，这种误差可以通过计算后校正。其次，尽管测序的绝大多数细胞明显是肾小球细胞，分离出的肾小球细胞纯度很高，但一部分肾小球细胞有可能起源于内皮细胞。第三，作者使用的是一种品系某个年龄段的雄性小鼠，其肾小球仍在发育。因此，观察到的肾小球细胞亚群在不同年龄、性别或品系的小鼠中也可能不一定稳定。
评论
总而言之，作者全面地研究了单个肾小球细胞中的基因表达。鉴定了所有肾小球细胞类型的新型标记基因，并发现了内皮细胞和足细胞异质性的证据。早期关于肾小球的单细胞RNA测序研究局限于集中在lyona单细胞类型上，并对少量细胞（分别为20个足细胞和14个系膜细胞）进行测序。相反，作者的方法利用了高通量单细胞测序的潜力，可以分析大量细胞。作为研究资源，提供了小鼠肾小球单细胞转录组测序数据库，可以免费访问和在线查询（https://shiny.mdc-berlin.de/mgsca/）。因此，本研究为未来解决单个肾小球细胞状态对疾病的反应铺平了道路，如狼疮性肾炎患者肾脏活检标本的初步研究。肾小球是一个关键系统，未来改进的单细胞RNA测序方案将加深对肾小球的理解。
更多推荐
1 科研 | 基于转录组和调控网络分析揭示了石斛降血糖作用及其机制（国人二区作品）