编译：伊亚飞，编辑：夏甘草、江舜尧。
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导读
人和鼠的基因组拥有大量的非编码核酸序列。非编码RNA在细胞核染色质上的定位与其调控功能紧密相关。相比细胞质定位的蛋白编码信使mRNA，众多的非编码RNA，比如长链非编码lncRNA（lncRNA）、和启动子和增强子调控元件关联的不稳定转录本（uaRNA、eRNA），更倾向于结合在染色质上参与调控染色质结构、转录和RNA加工等过程。尽管零星报导少数RNA核滞留的现象，但为何大部分lncRNA会滞留于染色质上行使调控功能，仍是个不解之谜。为了探究非编码RNA的染色质结合机制，研究人员建立了一套筛选参与RNA染色质结合关键顺式调控元件的系统，利用该系统对染色质结合的候选RNA进行关键顺式元件筛选，鉴定发现U1 snRNP的识别位点参与调控RNA与染色质的结合。抑制U1 snRNP的功能广泛降低了lncRNA、uaRNA、eRNA等非编码RNA与染色质的结合。机制上，U1 snRNP通过与磷酸化的RNA聚合酶II互作，以转录依赖的方式介导了非编码RNA与染色质的结合。本研究不仅揭示了U1 snRNP介导非编码RNA在染色质上功能和调控的新模式，而且拓宽了U1 snRNP这一被广泛研究的小核糖核蛋白粒子的新颖功能。
原名：U1 snRNP regulates chromatin retention of noncoding RNAs
译名：U1 snRNP调控非编码RNA的染色质结合
期刊：Nature
IF：40.137
发表时间：2020.03
通讯作者：尹亚飞&沈晓骅
通讯作者单位：清华大学医学院
DOI号：10.1038/s41586-020-2105-3
实验设计流程图
1REL-seq鉴定U1 snRNP识别位点调控RNA染色质结合
为了鉴定参与RNA染色质结合的关键顺式元件，我们首先建立了REL-seq实验方法（见图1）。具体而言，我们首先通过文库构建的方法将片段化的候选基因序列构建至文库报告载体系统，从而获得基因片段化文库，再进一步将该文库导入细胞中，通过生化方法将细胞分为细胞质、核质和染色质三个组分，分别提取各组分RNA，通过载体共有序列引物进行反转录及PCR，构建包含插入短片段序列的高通量测序文库。通过高通量测序分析鉴定短片段在不同组分的测序信号，从而筛选出参与候选RNA亚细胞定位的关键区域区域（图1，REL-seq）。进一步的，通过将REL-seq方法与随机突变相结合，使得其可以单碱基分辨率鉴定出参与RNA染色质结合的关键元件，我们称该方法为mutREL-seq（图1）。
图1 REL-seq及mutREL-seq实验流程。我们首先将候选基因的cDNA随机片段化，进一步进行末端修复、连接接头、扩增，再构建于三种（5AI，3AI，GFP）不同类型的报告基因PiggyBac表达载体中，接着通过共转染表达载体与表达PiggyBac转座酶的pBASE载体将报告基因随机整合到基因组中；进一步地，通过对整合有报告基因载体的细胞进行亚细胞分离，分别提取出细胞质、核质以及染色质组分的RNA，通过对RNA进行针对报告载体上插入片段下游的共有序列设计的特异性反转录引物（RT primer）进行反转录，再利用设计在插入片段上下游共有序列上的PCR引物（P1和P2）进行扩增，并进一步对扩增产物构建高通量测序文库，通过对高通量文库进行测序及分析从而鉴定出在染色质或者细胞质组分富集的RNA片段。对于mutREL-seq，通过对候选的目的片段进行错误倾向性PCR（error-prone PCR）的方式引入随机突变，再对突变的DNA片段构建REL-seq文库及下游的实验及分析，从而单碱基分辨率鉴定出参与RNA亚细胞定位的关键序列。ITR，PiggyBac的反向末端重复序列（inverted terminal repeat sequences）。
通过对候选RNA进行REL-seq及mutREL-seq分析，我们鉴定出一个7-nt的关键序列，突变该序列显著上调其RNA的细胞质/染色质的比例（图2a）。通过对该区域序列进行RNA二级结构分析发现，该序列位于一个暴露的环状区域进一步的序列分析发现其核心序列为一个U1 snRNP识别位点（图2b），我们进一步通过其它实验验证了U1识别位点及U1 snRNP参与调控RNA的染色质结合。进一步的生物信息学分析该U1识别位点在基因组上的分布发现，相比于蛋白编码基因，U1识别位点显著富集于lncRNA转录本（图2c，上）。与之相对应的，lncRNA基因组含有显著更低水平的3’剪接受体位点（3’ss）（图2c，下）。通过实验鉴定U1 snRNP在体内结合的RNA也同样证明其更倾向于结合lncRNA，且RNA与染色质的结合也与其与U1 snRNP的结合呈正相关（图2d）。这些结果均提示U1 snRNP可能广泛参与调控RNA与染色质的结合。
图2 REL-seq鉴定出U1识别位点调控RNA染色质结合。（a）MutREL-seq鉴定出7个降低RNA染色质结合并促进其细胞质定位的核苷酸（虚线框强调区域）。y轴表示胞质信号与染色质信号的倍数变化，并进一步用野生型细胞进行归一化。灰色点表示发生删除位点。（b）预测的候选RNA与U1 snRNA的二级结构及其相互作用的图。Ψ：G配对碱基由点表示。比例尺显示碱基配对（或缺乏配对）的概率大小。（c）预测的强U1识别位点（上图）和预测的潜在3’ss（下图）在lncRNA和mRNA基因的外显子或外显子的反向互补链序列中的分布比较。（d）RNA染色质结合强度（上图）、U1 RAP–RNA信号（下图）在不同染色质结合强度的mRNA基因和lncRNAs中的比较。
2U1 snRNP广泛调控lncRNA与染色质结合
为了进一步实验验证U1 snRNP广泛参与染色质结合，我们分别通过U1 AMO阻碍U1 snRNA的结合和构建U1 snRNP核心蛋白SNRNP70的AID快速诱导降解系统（SNRNP70AID, AID: auxin-inducible degron system）对U1 snRNP的功能进行抑制。U1 AMO抑制导致了1282条mESC中表达的lncRNA中的337条染色质结合下降，而只有4条lncRNA出现了染色质结合的上升（三个生物学重复而言，p <0.05）（图3a-c）。一致的，SNRNP70AID的快速降解导致346条lncRNA染色质上的结合但只有13条上调的lncRNA（图3a-c）。对于大多数染色质下调的lncRNA，例如Lncenc1，Tsix，Malat1，Pvt1和Meg3，在细胞质和/或核质组分中信号增加（图3b）。这一结果说明U1 snRNP广泛调控lncRNA与染色质的结合。另外，与转录调控元件关联的不稳定非编码转录本如uaRNA、eRNA等，它们的染色质结合在U1 snRNP抑制后也显著下降。同时，我们还进一步证明了U1 snRNP直接调控成熟lncRNA与染色质的结合，而不是通过影响RNA合成、加工或降解过程的动态变化所产生的间接影响。
图3 U1 snRNP功能抑制降低大量lncRNA与染色质的结合。（a）热图展示U1 AMO抑制或SNRNP70AID快速降解后染色质结合下调的lncRNA的染色质结合比例变化情况。（b）IGV截图展示U1 AMO抑制或SNRNP7OAID快速降解后候选lncRNA亚细胞定位高通量测序信号图以及TT-seq信号图。（c）火山图展示SNRNP70AID快速降解后RNA染色质结合变化情况。
3U1 snRNP通过与磷酸化的RNA聚合酶II互作介导lncRNA与染色质的结合。
为了探究U1 snRNP调控lncRNA染色质结合的机制，我们通过SNRNP70免疫共沉淀结合质谱（IP-MS）鉴定发现其可以互作于RNA聚合酶II（Pol II），我们进一步用IP-western验证了SNRNP70与磷酸化的而不与非磷酸化的RNA聚合酶II的互作（图4a）。转录抑制显著降低了U1 snRNP及其调控的RNA与染色质的结合（图4b），这进一步证实U1 snRNP主要通过与磷酸化的Pol II互作来介导LncRNA与染色质的结合。最后，我们通过以lncRNA Malat1为例，进一步验证了U1 snRNP对其染色质结合的调控作用。去除SNRNP70后，绝大部分Malat1 “核斑”定位信号消失，并弥散在核质及细胞质中（图4c）。同时，Malat1在活跃表达基因染色质区域的结合信号显著下降（图4d），表明U1 snRNP不仅可以将Malat1滞留在染色质上，同时也参与调控后者在染色质上的移动及其与靶基因的结合。
图4 U1 snRNP通过与磷酸化的RNA聚合酶II互作介导lncRNA与染色质的结合。（a）蛋白质印记检测未磷酸化或Ser2、Ser5磷酸化的RNA聚合酶II免疫共沉淀所富集下来的SNRNP70和SNRPC情况。（b）RT-qPCR检测不同转录或剪接抑制剂处理后U1 snRNA和候选lncRNA的染色质结合变化。（c）SNRNP70AID细胞（GFP阳性）与野生型细胞（GFP阴性）混合培养后生长素处理后SNRNP70的Malat1 RNA FISH图。（d）Meta基因分析展示Malat1 ChIRP-DNA-seq信号在mESC表达或不表达基因上的分布。（e）U1 snRNP调控非编码RNA染色质结合的模式图。
综上，我们提出如下模型（图4e）：5’和3’剪接位点在lncRNA上的不对称分布，致使U1 snRNP持续结合在lncRNA转录本上，而不能通过RNA剪接过程释放，从而介导了lncRNA的染色质滞留。磷酸化Pol II进一步介导了lncRNA-U1 snRNP复合体在染色质上的移动（mobilization）。对于大多数低丰度、不稳定的lncRNA，它们只能靶向结合邻近的染色质区域（顺式cis作用）；而对于少数稳定和高丰度的lncRNA，如Malat1，U1 snRNP促进了其迁移和结合更多的靶基因区域（反式trans作用）。在这里，我们通过建立顺式元件筛选体系鉴定发现U1 snRNP及其识别位点广泛参与非编码RNA的染色质结合。虽然其它调控lncRNA与染色质结合的机制如重复RNA序列等存在，我们的生物信息分析及实验数据均表明U1 snRNP所介导的RNA染色质滞留机制广泛调控lncRNA的亚细胞定位。这也为更好地探究和理解lncRNA的功能和作用机制提供了参考。同时，我们的工作也揭示了U1 snRNP除调控RNA剪接过程之外的又一新颖机制。这一发现与之前报道的U1-PAS轴调控启动子方向性以及抑制提前转录终止信号保证转录本的完整性很可能协同作用，共同保证基因转录激活、延伸、及RNA加工等步骤的有序进行和RNA转录本的正确定位。我们所揭示的机制在解析非编码RNA的功能和特性上具有一定普遍性和简约性。然而，我们认为，这只是RNA染色质滞留的机制之一，其它已经报道的以及我们的数据中也检测到可能机制同样存在。例如，之前的研究有报道，Xist基因内部的一些重复序列参与调控其与染色质的结合。我们通过REL-seq实验，在Xist的5'端发现了一个与重复序列A重叠的强染色质滞留区域，且已知该区域对于Xist介导的X染色体失活非常重要。而我们也进一步用RepA-GFP报告基因系统验证了这一结果。结合此前报道，重复序列A主要与蛋白SPEN互作，而我们也进一步通过对SPEN进行敲低进一步确认了这一结果。但把U1 snRNP组分SNRNP70敲低并不能降低RepA-GFP与染色质的滞留，表明重复序列A介导的GFP报告基因或者Xist的染色质滞留是不依赖于U1 snRNP的。同时，我们在Xist的重复序列D，E，F中鉴定到多个染色质结合区域。这也与此前报道的这些重复序列的确实会损伤X染色体的失活。而这些重复序列上均检测不到预测的U1 snRNA的结合位点以及U1 snRNA的结合，进一步表明它们是以U1 snRNP非依赖的方式介导的Xist的染色质结合。更为重要的是，Xist的U1 snRNP非依赖性RNA染色质滞留也与其功能息息相关。我们的研究表明，U1 snRNP主要通过与磷酸化的RNA聚合酶II互作来介导lncRNA与染色质的结合，而失活的X染色体往往缺乏RNA聚合酶II和相应的转录调控因子，且与U1 snRNP介导的RNA染色质结合不同，Xist与染色质的结合对转录抑制也不敏感。因此Xist的这种调控形式正好与其功能和作用机制息息相关。长链非编码RNA更倾向于结合染色质这一现象已经被报道多年，这也与很多lncRNA的功能息息相关。然而，关于lncRNA的染色质结合机制一直不明。此前的研究表明，蛋白编码基因和lncRNA被相同分子机器调控其转录、加工等过程，但二者的亚细胞定位却存在显著差异，暗示很可能其亚细胞定位信息隐藏在它们的RNA序列之中。本研究从筛选鉴定参与调控RNA亚细胞定位的顺式元件出发，并以此为突破口，鉴定出U1 snRNP广泛参与RNA的染色质结合，并对其调控机制进行了深入解析，很大程度上解释了长链非编码RNA为何更倾向于结合染色质这一现象。同时，该研究还发现，相比于蛋白编码基因，lncRNA含有更高水平的U1识别位点（同时也是潜在的5’剪接位点）以及更低水平的3’剪接位点，而U1 snRNP及其识别位点的经典功能是参与调控RNA剪接过程，成熟的RNA转录本往往含有更低水平的U1识别位点，因此，该发现也与此前报道的lncRNA的剪接加工效率更低、更不完全等现象息息相关。后续关于U1 snRNP与非编码RNA的其它特性的关系、及其调控非编码RNA相关特性的生物学意义仍有待进一步的研究。本论文的第一作者兼共同通讯作者尹亚飞现已以研究员的身份入职浙江大学医学院，课题组主要为探究非编码核酸对基因表达调控及其在细胞命运决定过程中的功能和作用机制（详见https://person.zju.edu.cn/yinyafei）。现诚聘博士后及科研助理，欢迎广大优秀青年学子加盟！
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