科研| ENVIRON INT：微塑料影响斑马鱼发育（国人佳作）
编译：荔枝，编辑：谢衣、江舜尧。
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论文ID
原名：Microplastics enhance the developmental toxicity ofsynthetic phenolic antioxidants by disturbing the thyroid function andmetabolism in developing zebrafish
译名：微塑料通过干扰发育中的斑马鱼甲状腺功能和代谢来增强合成酚类抗氧化剂的发育毒性
期刊：Environment International
IF：7.943
发表时间：2020.4
通讯作者：张宴
通讯作者单位：南京大学，环境学院
实验设计
用动力学吸附实验比较两种粒径MPs对BHA的吸附能力。3.2μL的MPs溶液和4μL的BHA(10g/L的DMSO)溶液加到一系列50mL的棕色玻璃管中。加入纯净水补足到40mL，最终浓度MPs和BHA分别为2 mg/L和1 mg/L，与后续暴露实验所用浓度一致。预定时间间隔后(0.5, 1, 2, 12, 24,48, 72, 96, 120 h)，用0.025μm的滤膜过滤。每个时间间隔进行三次重复。确保BHA被完全过滤。使用HPLC测定BHA浓度。
所有的斑马鱼被保存在一个循环水系统，28±0.5℃，光周期14/10 h(亮/暗)。每天用活的盐水虾喂食两次。收集受精卵，在E3培养基中孵育。将4组hpf胚胎随机分配到9个培养皿中，每个培养皿中含有20个胚胎和20 mL试验溶液。三组各用3个重复皿: MP(S)组、MP(L)组和对照组。处理组中，测试溶液添加荧光MP(S)或MP(L)，终浓度为20mg/L, 对照组仅使用培养水，不加MPs。持续处理7天。在实验过程中，每24小时刷新一次测试溶液。暴露后，每个培养皿随机抽取5只幼虫，PBS洗涤3次，0.03% MS-222麻醉。所有样品均冷冻干燥，并在- 80°C保存至分析。然后，使用荧光显微镜检测幼虫摄入的MPs。为了测试BHA和MPs的毒性，将4个hpf斑马鱼胚胎随机分为BHA、MP(S)、MP(L)、BHA + MP(S)、BHA + MP(L)和对照组。BHA和MPs的暴露浓度分别为1 mg/L和2 mg/L，暴露持续7天。在暴露期间，测试溶液每24小时更新一次。采用超高效液相色谱-串联质谱(UPLC-MS/MS)仪器检测幼虫体内BHA的积累。在72 hpf时，记录孵化率，并在室温下用光学显微镜连续观察1分钟以测量心率。在7dpf时，用相同的光学显微镜测量体长和畸形率。观察心包膜水肿、卵黄囊水肿、充血、脊柱畸形等发育异常。采用市售酶联免疫吸附试验(ELISA)试剂盒测定(三碘甲状腺氨酸的水平(T3)、甲状腺(T4)、促甲状腺激素的水平。每个实验重复三次。对BHA、MP(S)、BHA + MP(S)及对照组进行了椎体钙化及代谢组学的检测。暴露7天后，随机收集每个重复200只幼鱼和每个组5只重复，在液氮中快速冷冻。进行代谢物鉴定和通路分析。采用SPSS 19.0软件进行统计分析。
实验结果
3.1 MPs对BHA的吸附
BHA的吸附在初始阶段是一个快速的吸附过程，随后吸附速率逐渐减慢，直至吸附平衡(图.1)。2h后各时间点MP(S)的吸附量均高于MP(L) (p < 0.05)。孵育72h，达到一般吸附平衡，MP(S)的吸附BHA量为70.12±4.45μg/g，MP(L) 的吸附量为47.98±4.56μg/g。结果表明，粒径在吸附过程中起着重要作用，粒径越小的MPs吸附BHA量越大。
图.1 两种尺寸的MPs对BHA的吸附(n=3)。
*表示MP(S)和MP(L)在每个时间间隔内的BHA吸附量存在显著差异(T-test, p < 0.05)。
3.2 MPs在幼虫体内的吸收和分布
在毒理学实验前，检测了不同大小MPs在斑马鱼幼体中的吸收和分布。暴露后7天，对照组未见MPs(图.2A)。同时,65 nm和20μm的MPs主要在幼虫的胃肠道(GIT)中观察到(图.2B和C)。颗粒大小是生物体吸收和分配MPs的主要物理化学因素。例如,5μmMPs可以积聚在斑马鱼鱼鳃、肝脏和肠道,而20μmMPs只能留在鳃和内脏。2–16μm的MPs主要集中在M. edulis肠腔和消化管中，10μm议员可以运输到贻贝的循环系统。纳米塑料甚至可以穿过鱼的血脑屏障，在鱼的脑组织中积累。此外，暴露途径也影响生物体中组织特异性MPs的吸收和积累。对于斑马鱼幼虫和成年斑马鱼来说，MPs的主要摄取途径是通过口腔，因此MPs主要在GIT中积累。
3.3 MPs增加了斑马鱼幼仔BHA的生物积累
暴露7天后，与单用BHA相比，BHA + MP(S)和BHA + MP(L)中的BHA累积量分别升高164.4%和133.6%(F(5.18) = 15.89, p < 0.05)(图.2D)，同时，MP(S)诱导斑马鱼BHA的生物积累量高于MP(L)，但无显著性差异。这些结果表明，MPs的吸附和转运促进了BHA生物积累，其过程受颗粒大小的影响。一方面，小尺寸MPs的较大比表面积有利于吸附和运输更多的污染物，另一方面，MPs会破坏肠道上皮细胞的完整性，增加其他污染物对颗粒的吸收进入。同样，MPs的载体效应增强了有机污染物的积累，这在以前的研究中也有报道。然而，Trevisan等人发现多环芳烃(PAHs)对聚苯乙烯纳米塑料的吸附降低了斑马鱼幼体中PAHs的生物积累和预期的致畸性。与我们的研究相反的结果可能是由于研究中使用的36种不同分析的PAHs的真实环境混合物，它们来自由水和悬浮固体组成的沉积物提取物。相对复杂的吸附体系可能导致不同的相互作用结果。聚苯乙烯纳米塑料表面吸附PAHs增加了纳米塑料的亲脂性，促进了PAHs的进一步聚集和吸附，从而降低了生物利用PAHs的浓度。此外，浓度相对较高(10ppm)的纳米塑料可能导致不同的吸附结果。因此，更好地理解MPs和其他个别污染物之间的相互作用是很重要的，这可能取决于MPs的特性。(例如，化学成分，大小和表面电荷)，污染物的类型和它们的浓度。此外，增加的BAH积聚可能会引发更严重的毒性效应，下文将对此进行进一步探讨。
3.4 MPs增强了BHA的发育毒性
在毒性实验前，通过一系列初步暴露实验选择MPs和BHA的浓度。选择中等浓度的MPs (2 mg/L)进行共暴露，该浓度的MPs不引起幼鱼的发育毒性。在以前的研究中，也使用相似浓度的MPs (~ 1mg /L)来探索斑马鱼幼体对MPs的吸收和毒性，并诱导最小发育毒性。对于BHA来说，只有1mg/L的浓度抑制孵化并产生畸形(图. 3)。已有研究表明，1.8 mg/L的BHA可降低孵化率和0.9 mg/L BHA可诱导斑马鱼幼体形态畸形。
暴露于BHA、MPs和BHA + MPs 7天后，与对照组相比，体长无明显变化。两种尺寸的MPs与对照相比，在孵化率、心率和畸形率方面均无明显变化(图. 3A.B.C)。与对照组相比，BHA和BHA + MPs显著降低孵化率(F(5.18) = 54.62, p < 0.05)，显著增加畸形率(F(5.12) = 13.91, p < 0.05) (图. 3A.C)。此外，BHA + MPs对孵化率和畸形率的影响也大于BHA (p < 0.05)。此外，BHA + MPs对孵化率和畸形率的影响也大于BHA (p < 0.05)。在心率方面，BHA + MPs暴露显著降低(F(5.18) = 4.38, p < 0.05)，但单纯BHA未引起明显变化(图. 3B)。这些数据表明，BHA和MPs的混合物危害更大。如上所述，共暴露增强的发育毒性可能是由于BHA积累的增加。另一方面，虽然MPs浓度不够高，不能诱导明显的发育毒性，但可能会干扰一些参与发育的关键激素和代谢。
图. 3 在斑马鱼幼鱼中，BHA (1mg /L)和MPs (2mg /L)暴露引起孵化率(A)、心率(B)、畸形率(C)、T3水平(D)、T4水平(E)和TSH水平(F)的变化。
不同字母表示治疗组间差异有统计学意义(ANOVA and Tukey tests, p <0.05)。
3.5 BHA和MPs共暴露扰乱甲状腺激素
为了验证上述假设，我们检测了BHA和MPs暴露对甲状腺激素(T3、T4、TSH)的影响(图. 3D.E.F)。与对照组相比，经MPs处理后T3水平无明显变化。MP(S)暴露T4略有增加，但无统计学意义。与对照组比较，MP(S)明显升高了TSH (F(5.12) = 19.36, p < 0.05)水平。BHA显著增加T4 (F(5.12)=13.69, p < 0.05)和TSH (F(5.12) = 19.36, p< 0.05)。共暴露导致T4显著升高(F(5.12) = 13.69, p< 0.05) TSH (F(5.12) = 19.36, p < 0.05)，降低了T3 (F(5.12) = 6.87，p < 0.05。BHA + MP(S)对三种甲状腺激素的影响均大于单纯BHA (p < 0.05)。这些结果表明，个体BHA和MP(S)可以干扰甲状腺激素，其混合物增强效果。甲状腺功能紊乱可导致斑马鱼胚胎发育不良，如发育缺陷。在鱼类中，甲状腺激素的合成是通过下丘脑-垂体-甲状腺(HPT)轴来调节的。研究表明，BHA和MPs均可引起HPT轴的改变，提示BHA与MPs对斑马鱼甲状腺激素有协同作用。
3.6 BHA和MPs共暴露可减少椎体钙化
为了揭示BHA和MPs对甲状腺激素紊乱的作用结果，在幼鱼中评估脊椎钙化，骨骼发育的生物标志物(图. 4)。BHA、MP(S)、BHA + MP(S)暴露12天后，BHA、BHA + MP(S)组椎体钙化数较对照组明显减少(F(3,8) = 33.51, p < 0.05)。BHA + MP(S)组椎体数较BHA组明显减少45.8% (F(3,8) = 33.51,p < 0.05)。但是，在MPs处理组中椎体钙化未见明显变化。这些结果表明，BHA和MP(S)可导致更严重的骨骼畸形，是影响鱼类外部形态及其生存和生长的主要因素。甲状腺功能正常对于骨骼的正常发育和骨骼结构及力量的维持至关重要。T3和T4是骨骼发育和线形生长所必需的。相反，TSH同时抑制成骨细胞和破骨细胞的功能，是骨骼发育的负调控因子。如上所述，联合暴露组TSH升高，可能导致钙化椎体减少。
图. 4 BHA和MPs对斑马鱼幼体椎体钙化的影响。
(A)暴露于1mg /L BHA和2mg /L MPs12天后，幼虫椎体钙化的代表性图像。(B)幼虫暴露于BHA和MPs 12天后的钙化椎体数量的统计结果(n = 10)。不同字母表示治疗组间差异有统计学意义(ANOVA and Tukey tests, p < 0.05)。
3.7 BHA和MPs共暴露干扰发育相关的代谢
应用代谢组学分析幼鱼对BHA和MPs暴露的代谢变化，可能从组学角度揭示新的毒性分子机制。PLS-DA模型显示了暴露于BHA、MP(S)和BHA + MP(S)后，幼鱼代谢反应的不同模式。BHA + MP(S)组与其他治疗组及对照组明显分离(图. 5A)。暗示了联合处理与单独的BHA和MP(S)相比，BHA和MP(S)引起了幼鱼代谢组有显著干扰。BHA组、MP(S)组和BHA + MP(S)组分别鉴定出79，37和62个SCMs(图. 5B)。在这些SCMs中，BHA组和BHA + MP(S)组共享40个代谢物(图. 5B)。共享的SCMs可分为花生四烯酸(50%)、甘油磷脂(12.5%)、氨基酸(17.5%)和其他(30%)(图. 5C)。与对照组相比，BHA和BHA + MP(S)暴露显著上调了5个氨基酸代谢物，显著下调了4个甘油磷脂代谢物，几乎下调了花生四烯酸代谢物。对于这些被下调的代谢物，BHA + MP(S)暴露的影响强于BHA。
通过pathway分析，这些常见的SCMs主要参与花生四烯酸代谢、甘油磷脂代谢和氨基酸代谢(图. 6)。值得注意的是，BHA和BHA + MP(S)暴露最相关的代谢途径是花生四烯酸代谢和甘油磷脂代谢，在甲状腺激素调节和骨骼发育中发挥重要作用。
花生四烯酸是一种典型的长链多不饱和脂肪酸，是鱼类重要的营养物质，尤其对仔鱼维持最佳生长、繁殖和整体健康有重要作用。花生四烯酸可被多种酶代谢，产生多种生物活性。例如，鱼类的花生四烯酸代谢物包括前列腺素、白三烯和中间的脂氧合酶产物，如5-羟色胺及其衍生物。在本研究中，5-HETE、5-Oxo-ETE、14、15-LTE4、15- pga1和前列腺素衍生物因MPs和BHA暴露而显著下调，可能影响斑马鱼幼体骨骼发育，因为花生四烯酸及其代谢物参与了骨形成和骨重塑。在此，在暴露于MPs和BHA的幼鱼中已证实椎骨缩小。
甘油磷脂代谢与甲状腺功能减退有关，在甲状腺功能减退症的临床患者中发现了甘油磷脂家族的功能障碍。本研究中，由于BHA + MP(S)暴露，溶血细胞、PEs和甘油磷脂代谢相关的甘油磷脂胆碱的代谢物均发生显著改变，提示甘油磷脂代谢与甲状腺激素紊乱有关。甲状腺激素异常可阻断脂质和脂肪酸的转运，抑制TCA循环，最终影响整个机体能量代谢过程。
此外，磷脂酰丝氨酸(PS)，磷脂酰乙醇胺(PE)和磷脂也发生了显著变化，表明MPs和BHA共暴露后导致脂质代谢紊乱。脂质在能量供应和维持正常代谢活动中起着重要作用。特别是，脂质是胚胎形成和孵化所需要的主要能量来源之一。脂质代谢紊乱可导致斑马鱼胚胎和幼体发育迟缓和发育畸形，MPs和BHA共暴露后斑马鱼幼体孵化率和畸形率的明显变化证实了这一点。
(A)暴露于BHA和MPs后，显示不同代谢反应模式的PLS-DA评分图。(B)表示显著变化代谢物数量的维恩图(SCM)。(C) BHA和BHA + MP(S)组间常用标准物质的热图。颜色条表示代谢物的相对含量。
图. 6 BHA和BHA + MP(S)暴露对常见SCMs的通路分析
与对照组相比，红点表示上调，绿点表示下调。
3.8 对环境的影响
本研究提示MPs在水生环境中可能导致生物积累和BHA毒性增加。MPs可以帮助将更大比例的BHA转移到食物链中，为生态系统功能和人类健康提供MPs复合污染的早期预警。这项研究也首次证明了MPs和BHA的共同暴露会导致斑马鱼发育毒性。甲状腺功能障碍和代谢紊乱对早期生命阶段的影响可以转移到晚期生命阶段，导致个体生存能力下降，甚至进一步威胁野生种群的健康。因此，本研究的结果突出了进一步研究MPs和添加剂在水生物种，特别是人类消费的水生物种中的联合作用的重要性，因为这些物质在日常生活和环境中都是普遍存在的。
讨论
原文网址：https://doi.org/10.1016/j.envint.2020.105750