科研 | 香港浸会大学：多层糖蛋白组分析揭示了全氟辛烷磺酸（PFOS）暴露小鼠的肝毒性机制（国人佳作）
编译：阿温，编辑：Tracy、江舜尧。
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实验设计
1. 采用蛋白质组的无标记定量（LFQ）定量分析PFOS和野生型小鼠中的蛋白质；
2. 对于糖蛋白和糖基化位点的定量，HILIC富集用于选择性结合糖肽，然后PNGase F去除N-连接的聚糖，用一致序列N-X-S/T（X≠脯氨酸）确定的糖基化位点；
3. 使用Metascape对失调的糖类和蛋白质组进行综合分析，以研究PFOS诱导的肝毒性途径和机制；
4. 使用STRING在线工具和Cytoscape插件“网络分析仪”绘制网络的拓扑和功能富集分析图，以了解过度表达的蛋白质和糖蛋白之间的关系。
实验结果
1. PFOS暴露小鼠肝脏多层糖蛋白的整体和异质性分析
在本研究中，有多种技术被用于定量PFOS和野生型（WT）小鼠肝脏的蛋白质组、糖蛋白组和糖类（图1a），蛋白质组的无标记定量（LFQ）分析确定了PFOS和野生型小鼠中2439种蛋白质的定量（图1b）。对于糖蛋白和糖基化位点的定量，HILIC富集用于选择性结合糖肽，然后PNGase F去除N-连接的聚糖，用一致序列N-X-S/T（X≠脯氨酸）确定的糖基化位点，发现799个蛋白质上总共有1292个N-糖苷被量化（图1b）。总的来说，小鼠肝脏中的全局（糖蛋白）蛋白质组由2439个蛋白质、799个糖蛋白和1292个糖基组成，其中73个糖蛋白通过糖蛋白组学分析进行了专门定量，726个通过蛋白质组学进行了定量（图1c）。多层分析提供了PFOS和野生型小鼠肝脏的蛋白质组、糖蛋白组和糖类的综合视图。
糖肽和糖肽在蛋白质上的分布显示了肝脏蛋白质糖基化的微观异质性。大约62.95%的糖蛋白有一个N-糖基，而2.12%的N-糖基化程度最高的蛋白质有五个以上的位点（图1d）。小鼠肝脏中最不均一的糖蛋白包括FAS、THIM、SODC、SPTN1、LRP1，每个糖蛋白上有8个或8个以上的糖基。与肝脏蛋白质组中的整体蛋白质相比，糖蛋白主要分布在胞外外体、细胞质、细胞质和线粒体中（图S1a）。糖蛋白的分子功能在RNA结合、催化活性、细胞粘附、氧化还原酶和水解酶活性方面过度富集（图S1b），表明蛋白质糖基化在这些功能中很重要。
图1 （a） PFOS暴露小鼠肝脏多层糖蛋白组分析的工作流程。（b-d）整体蛋白质组、糖甙、糖肽的总体特征。
2. 定量糖蛋白组学分析显示，暴露于PFOS的小鼠肝脏中存在异常的蛋白质糖基化
为了最小化潜在的生物学差异，我们用随机值代替PFOS和野生型小鼠之间缺失的LFQ值，以模拟未检测到的低强度。LFQ强度直方图呈正态分布（图S2），在蛋白质组学分析中，2439个蛋白质中有241个发生了显著变化，其中112个在PFOS小鼠中上调，129个在PFOS小鼠中下调，标准为fold change（FC）≥2，p值<0.05（图2a）。在134个差异糖蛋白中，60个显著上调，74个降低（FC≥2，p值<0.05）（图2b）。生物三份样品内以及PFOS和野生型小鼠之间的皮尔逊相关系数分别为0.90和0.76，因此LFQ具有良好的重复性（图2c），PFOS小鼠的独立聚类进一步证明PFOS影响（糖类）蛋白质组（图S3）。
在这些数据中，有285个差异表达（糖蛋白）被单独量化（蛋白质组196个，糖蛋白组89个），但45个重叠（图2d）。我们用重叠45个（糖）蛋白的FC比值（RG/P）来指示它们受蛋白质丰度或蛋白质糖基化的调节。RG/P直方图显示33个重叠蛋白（73.3%）位于比率大于1的范围内，表明这些蛋白在糖基化水平发生改变，应该是糖蛋白（图S4，表S1），例如，RG/P 为2.57的ECH1在蛋白质组中具有1.18的低FC，而在糖蛋白质组中具有3.03的低FC，表明在蛋白质糖基化水平上受到调节。
对改变蛋白质的KEGG途径分析显示，在PFOS小鼠中，核糖体、脂肪酸降解、过氧化物酶体和药物代谢-细胞色素P450明显失调（图2e）。与之相比，糖蛋白，尤其是影响氨基酸生物合成和代谢的糖蛋白，仅富集于甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸代谢、乙醛酸和二羧酸代谢以及内质网中的蛋白质加工（图2e）。
图2 PFOS暴露与野生型小鼠肝脏之间的定量糖蛋白组学分析
差异表达蛋白（a）和糖蛋白（b）的火山图。垂直线为2的褶皱变化，水平线为p值0.05。（c）生物学重复之间log2转换LFQ强度的皮尔逊相关分布。（d）差异蛋白和糖蛋白的维恩图。（e）分层聚集KEGG富集项。热图单元格上的P值是彩色的。灰色是不存在的富集项。
3. 暴露于PFOS的小鼠肝脏糖蛋白组失调途径及肝毒性机制分析
我们使用Metascape对失调的糖类和蛋白质组进行综合分析，以研究PFOS诱导的肝毒性途径和机制。一个圆形定量图显示，与PFOS暴露小鼠中的蛋白质相比，失调的糖蛋白参与的途径明显不同（图3a，b）。而对层级聚集术语的进一步探索表明，失调的糖蛋白组仅参与中性粒细胞脱颗粒、细胞对应激的反应、内质网中的蛋白质加工（图3c）。来自每个簇的代表性术语的子集被转换成基于相似性分数的网络布局，并使用如图3d-f所示的细胞景观进行可视化，而对于下调糖蛋白，没有关系的分散子网络的聚类分析没有产生太多有价值的信息（图S5）。
3.1 蛋白质组学显示，暴露于PFOS的小鼠肝脏脂质和外源性代谢紊乱
肝细胞具有代谢、生物合成、解毒和免疫应答等多种功能。大量证据表明，PFOS可激活啮齿动物体内的PPARα，参与肝脏肥大的诱导，并改变包括脂质代谢、过氧化物酶体和线粒体β-氧化、脂肪酸摄取以及脂蛋白组装和转运等基因的表达。在本研究中，该网络包括标记为脂肪酸代谢、脂肪酸降解、不饱和脂肪酸生物合成的簇，这些簇由蛋白质和糖蛋白的术语组成（图3d，f）。研究表明，Cyp4a家族、Acot1、Acox1和Ehhadh受PPARα调控，因此，PFOS会增加和积累细胞内游离脂肪酸，从而导致肝脏肿大，并上调脂肪酸β-氧化。
此外，非糖蛋白仅参与外源代谢，在化学致癌和药物代谢簇中高度富集（图3d-f）。Cyp3a11是孕烷X受体（PXR）的一个靶基因，其表达上调了32.78倍，对调节代谢和外源性转运至关重要。Gst、Ces和UDPGT家族也与Nfr2相关，Nfr2是氧化应激激活的转录因子，因此，PFOS对Cyp、Gst、Ces和Ugt的上调作用可能与PXR、Nrf2和PPARα受体有关。
图3 PFOS暴露小鼠肝脏中过度表达基因的蛋白质-糖蛋白网络
Circos图是基因（a）和功能类别（b）的重叠分析。紫色曲线链接相同的基因，蓝色曲线链接属于相同的丰富本体术语的基因。内圆代表基因列表，沿着弧线排列。重叠的基因以深橙色着色，而列表中唯一的基因以浅橙色显示。外圈代表蛋白质（蓝色）和糖蛋白（红色）的类别。（c）蛋白质和糖蛋白列表中KEGG和Reactome富集项的热图，用p值着色。（d）节点显示为pie的丰富集群网络。在每个派中，不同颜色的切片代表糖蛋白（红色）和蛋白质（蓝色）。该区域的切片与从代表的基因列表中出现的命中数成正比。饼图中仅显示对相关术语显示显着富集的基因列表。（e）相同的富集网络，节点用P值着色。较深的颜色代表更高的丰富意义。（f）相同的富集网络，节点由cluster-ID着色。圆圈节点代表每个项。节点大小与属于该术语的基因数量成正比，而节点颜色代表其所属簇的身份。对于每个聚类，都选择了最丰富的术语来描述其ID。
3.2 糖蛋白组只参与内质网应激、中性粒细胞脱颗粒和抗氧化
胞浆中脂肪酸的积累会增加过氧化物酶体和内质网中脂肪酸的氧化。脂质过氧化通过分泌TNF-α、IL-1、IL-6和IL-12等促炎性细胞因子，破坏细胞膜结构和功能，刺激固有免疫应答，导致中性粒细胞趋化。中性粒细胞，包括嗜蓝、特异性和明胶酶颗粒，以及分泌囊泡，在先天免疫系统中起着关键作用，形成抵御外界刺激的第一道防线，而ASAH1、CAT、HP、HSP90AA1、ORM1、ACAA1A、VCP、HSPA1A和CREG1是中性粒细胞颗粒中过度表达的糖蛋白。中性粒细胞脱颗粒是一个分泌多种分子的过程，包括抗菌蛋白、蛋白水解酶和其他储存在颗粒内的促炎物质，主要有助于吞噬后杀死病原体，并可能在胞外释放后损伤宿主组织。中性粒细胞过度活化可能是肝损伤的重要诱因；同时，中性粒细胞介导的氧化应激可引起肝细胞线粒体功能障碍，从而引发额外的线粒体氧化应激。临床上，循环中性粒细胞功能指标是急性肝衰竭的重要生物标志物，其中粒细胞集落刺激因子（G-CSF）可提高急慢性肝衰竭患者的生存率，因此，PFOS影响的中性粒细胞糖蛋白变化可能是PFOS暴露毒性的潜在生物标志物。
此外，肝脏中大量错误折叠的蛋白质和脂质的积累，诱导内质网应激反应，恢复内质网稳态。在本研究中，内质网相关降解（ERAD）是一种减轻未折叠或错误折叠蛋白质的危险影响的蛋白质质量控制系统，在内质网的蛋白质加工途径中被发现。Hsp90（HSP90AA1）、Hsp70（HSPA1A）和Hsp40（DNAJC3）是ERAD底物选择的常用伴侣，内质网管腔的Hsp70在这类分子伴侣中起着双重作用，参与蛋白质的成熟和折叠以及错误折叠蛋白质的靶向和降解。p97（VCP）参与ERAD底物的反转录易位，其表达上调2.25倍，并与其辅因子（NSFL1C，2.74倍）锚定在内质网膜上，与泛素化底物相互作用。ERAD底物识别的另一种形式是蛋白质上的N-聚糖部分修饰，含有多糖再加成的底物与凝集素样伴侣calnexin（CANX）和GTP结合蛋白SAR1b（SAR1b）结合，这两种蛋白有助于蛋白质正确折叠和从内质网转运。载脂蛋白B（ApoB）显著下调24.37倍，导致VLDL合成和分泌受到抑制，并可能转化为肝脏脂质积聚。内质网应激不仅介导载脂蛋白B以蛋白酶体依赖性和非依赖性的方式降解，从而降低肝脏分泌VLDL的能力，而且抑制脂肪酸氧化，导致脂质积聚和脂毒性加重。
此外，由于过度脂肪酸氧化、内质网应激和中性粒细胞介导的氧化爆发引起的氧化应激，包括CAT、GSR、GPX4在内的抗氧化酶显著增加。Gpx4通过防止膜脂过氧化在保护细胞免受氧化损伤方面起着关键作用，并首次报道与PFOS毒性有关。
总之，PFOS暴露引起的肝毒性包括脂质积聚、VLDL转运中断、脂肪酸氧化紊乱、内质网应激和中性粒细胞相关的先天免疫反应。这些过程对肝脏有害，因为它们促进脂肪变性，并造成肝脏疾病进展的恶性循环。更重要的是，这些途径的激活也促进了从脂肪变性到严重阶段的转变，如脂肪性肝炎、纤维化、肝硬化，甚至肝癌，尤其是通过促进炎症、氧化应激和细胞死亡，图4给出了PFOS诱导的脂肪毒性和改变肝细胞稳态的可能示意模型（表S2）。
图4 PFOS暴露诱导肝毒性的示意模型
包括脂质积聚和通过激活PPARα（1）扰乱脂质代谢，以及通过激活内质网应激（3）VLDL转运中断和中性粒细胞脱颗粒（2）引起的级联反应。抗氧化反应（4）和外源代谢（5）在肝细胞保护中起重要作用。
4. 蛋白质-糖蛋白相互作用组分析显示HP和HSP90AA1是PFOS诱导肝毒性的潜在糖生物标志物
为了更好地理解过度表达的蛋白质和糖蛋白之间的关系，我们使用STRING在线工具和Cytoscape插件“网络分析仪”绘制网络的拓扑和功能富集分析图（图S6）。建立了包含148个节点和441条边的交互网络，置信度高达0.7。Cyto-Hubba是一个hub分析软件，用于识别交互网络中的hub蛋白。根据瓶颈（BN）算法确定排名前50%的蛋白质，这些蛋白可能代表网络中的关键节点（图5a）。
在两个拓扑参数的散点图（图5b）中，轴心节点在网络中具有最高的BN分数和介数值，即CAT、EHHADH、EPHX2、CYP4A10、ACOX1、FABP1和HSP90AA1。CYP3A11（32.78倍）、HP（50.01倍）和APOB（下调21.25倍）也被选为轴心节点，因为折叠变化较大（表1）。值得注意的是，10个中枢中有6个是糖蛋白（蓝点），其中，CAT是与EHHADH、EPHX2、ACOX1和HSP90AA1相互作用最为密切的轴心蛋白，与过氧化物酶体活性、抗氧化和免疫功能密切相关。CYP3A11与CYP4A10相互作用，是外源代谢的中枢蛋白；FABP1与APOB的相互作用与脂肪酸转运有关；HSP90AA1和HP在蛋白质折叠和合成与中性粒细胞脱颗粒之间的相互作用中起着关键作用。我们的基因-疾病关联分析结果显示，大多数过度表达（糖蛋白）蛋白与化学诱导的肝毒性、肝炎、脂肪肝、脂肪性肝炎、肝硬化，甚至HCC显著相关（图S7），因此，这10个枢轴蛋白是通过从癌症基因组图谱进行RNA表达概述来验证的。除CYP4A10和CYP3A11外，8种枢轴蛋白在肝癌中的过度表达具有统计学意义（图S7），值得注意的是，Hp和Hsp90aa1在RNA表达和存活分析中均发生了显著变化（图S8、9），它们作为PFOS的糖类生物标记物具有很大的潜力。
Hsp90aa1是hsp90家族的诱导型亚型之一，在应激后蛋白的折叠、稳定新蛋白以及变性蛋白与其他共伴蛋白的复性中起重要作用。HSP90也是一种重要的伴侣蛋白，广泛的致癌客户蛋白，如细胞周期蛋白依赖激酶4（CDK4）的活动，肝癌的发展。HSP90表达是一种潜在的临床诊断糖类标志物。
结合珠蛋白（Haptoglobin，HP）是肝脏分泌的一种与血红蛋白结合的急性期蛋白，在炎症和恶性肿瘤的反应中起重要作用。HP在其β链上有四个潜在的N-糖基化位点，由于其作为肝脏疾病异常糖基化的报告分子的潜力而受到越来越多的关注。Goldman及其同事分析了HP的位点特异性糖型，结果显示，与健康对照组相比，肝病组中14种岩藻糖基化糖型显著增加，表明HP是肝病早期检测和预测的潜在糖生物标志物。因此，在本研究中，轴心蛋白在形成枢纽节点的蛋白质中被鉴定，并且是PFOS肝毒性诊断、监测和预测的潜在生物标记物。
图5 （a）使用瓶颈算法确定的顶级焦点中心的交互网络显著影响路径。色阶表示折叠变化。标签大小表示中间值。矩形和圆形的节点分别对应于蛋白质和糖蛋白。（b）中心度参数散点图。蓝色圆点的符号是糖蛋白，紫色矩形是蛋白质。
表1 蛋白-糖蛋白相互作用组内枢轴蛋白的详细信息
结论
本研究采用多层糖蛋白组学技术对PFOS染毒小鼠肝脏蛋白质糖基化的调控进行了全面的研究，PFOS引起的肝脏肿大和脂质代谢紊乱不能简单地用PPARα激动作用模式来解释。内质网应激和中性粒细胞脱颗粒的级联反应也可能在肝毒性中起重要作用，此外，通过定量分析和相互作用组分析确定了潜在的糖类生物标志物。我们的研究结果表明，整合的糖蛋白组学有助于更好地理解蛋白质糖基化和PFOS的多种生物学效应，这些数据集将是进一步研究PFOS在糖基化或其他PTM方面的用处，它也有助于确定PFOS的新细胞靶点，并有助于评估与接触这类重要含氟化学品有关的人类和环境风险。