科研 | PNAS：二甲双胍对由线粒体过度活跃引起的帕金森氏病表型的治疗作用研究
编译：郭欣，编辑：Emma、江舜尧。
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帕金森氏病（PD）是全球最常见的神经退行性运动障碍，其患病率会随着人口老龄化而显著增加。RNAi介导的BCAT-1敲除秀丽隐杆线虫可以概括PD样特征，包括随着年龄的增长而产生的进行性运动功能障碍和神经退行性变。为了鉴定新的PD基因，作者开发了一种致疾病探索方法。该方法结合了人类全基因组关联研究与组织特异性功能遗传网络以及秀丽隐杆线虫的高通量行为筛选。使用此计算实验框架，作者发现PD与支链氨基酸转移酶1（BCAT-1）之间的联系，这是催化了支链氨基酸（BCAA）分解代谢的第一步。在健康人脑的PD易感区域中，BCAT-1表达通常较高，而在散发性PD患者的黑质中，其BCAT-1表达降低。此外，作者发现BCAA代谢功能异常通过诱导线粒体过活跃状态，导致帕金森氏样运动障碍和神经退行性变。2型糖尿病药物二甲双胍能够通过减少线粒体呼吸来改善神经元的生存能力。这些结果提供了线粒体机能亢进作为帕金森氏病中线粒体功能障碍的新潜在机制，并表明在疾病早期减少线粒体呼吸的途径（可能是通过二甲双胍治疗）可能是有效的。
论文ID
实验设计
实验结果
1. BCAT-1基因敲除导致运动功能障碍
神经元的转录分析揭示了PD的BCAT-1（RNAi）秀丽隐杆线虫模型中糖酵解和TCA循环途径的上调。为了模拟在PD患者黑质中观察到的BCAT-1减少，作者进行了特异性RNAi介导的秀丽隐杆线虫BCAT-1的敲除，结果显示仅在神经系统中敲除BCAT-1会导致严重的痉挛状“卷曲”（图1A），BCAT-1敲除加剧了细胞体的损失以及神经突的分裂和起泡（图1B）。多巴胺变性与秀丽隐杆线虫的基础减慢反应有关（图1B），BCAT-1敲除消除了线虫的基础减慢响应（图1C）。为了了解BCAT-1减少如何导致神经退行性病变和运动功能障碍，作者首先研究了哺乳动物雷帕霉素（mTOR）通路的靶标，该通路先前与BCAT-1的寿命调节有关。研究发现丢失mTOR/let-363和雷帕霉素都不会对卷曲行为产生任何影响，这表明mTOR途径不与BCAT-1相互作用来调节PD相关的表型（图1D和E）。
图1 BCAT-1基因敲除导致运动功能障碍，并通过mTOR独立机制促进神经退行性变
（A）RNAi介导的BCAT-1敲低导致老年动物出现严重的痉挛样“卷曲”运动功能障碍；（B）在多巴胺能神经元中表达α-突触核蛋白的神经元RNAi敏感线虫中，BCAT-1敲低会加速CEP和ADE多巴胺能细胞体（箭头）和神经突（箭头）的变性；（C）在多巴胺能神经元中表达α-突触核蛋白的线虫中，多巴胺能依赖性的基础减慢行为在第5天仍然完好无损，而BCAT-1的额外敲除则不存在；（D和E）第8天的卷曲不受bTOR-1敲除的神经元RNAi敏感线虫（菌株TU3311）中mTOR/let-363敲除（D）或雷帕霉素处理（E）的影响。
2. BCAT-1相关的PD表型与糖酵解和TCA周期基因的神经元上调相关
作者对成年秀丽隐杆线虫组织进行分离和RNA测序，用BCAT-1或对照RNAi处理对神经元RNAi敏感的秀丽隐杆线虫，并在成年后第5天（严重运动功能障碍之前的一个时间点）收集神经元以阐明发生和驱动疾病的机制。BCAT-1（RNAi）处理的样品和对照RNAi处理的样品是截然不同的，并且大多数差异表达（错误发现率<0.05）基因（图2A）曾被鉴定为在成年野生型秀丽隐杆线虫中神经元表达（图2B）。为了测试破坏BCAA途径组分是否产生运动功能障碍，作者将成年的神经元RNAi敏感线虫喂食RNAi，并在第8天测试其卷曲，结果显示单独破坏acdh-1或dbt-1足以引起卷曲（图2C和D）。由于acdh-1在缬氨酸和异亮氨酸代谢中起作用，而在亮氨酸代谢中不起作用，因此作者测试hach-1和ivd-1。结果显示在每种情况下敲除hach-1和ivd-1足以产生卷曲（图2D），表明这三种BCAA中任何一种的代谢缺陷都可能导致运动功能障碍。作者进一步检查了碳代谢，特别是糖酵解和三羧酸（TCA）循环，因为BCAA代谢与这些生物能途径密切相关（图2F）。这些途径中的大多数差异表达基因在BCAT-1（RNAi）神经元中被上调（图2F），表明BCAT-1敲除可能促进对BCAA代谢变化的协调转录反应。
图2 BCAT-1相关的PD表型与糖酵解和TCA周期基因的神经元上调相关
（A）火山图显示BCAT-1（RNAi）神经元的上调（紫色）和下调（绿色）基因；（B）维恩图证实大多数差异表达的基因在神经元中表达；（C和D）dbt-1（C），acdh-1，hach-1或ivd-1（D）的破坏引起线虫卷曲；（E）BCAT-1（RNAi）神经元中上调的基因的KEGG分析；（F）BCAA，糖酵解和TCA循环途径示意图，其中BCAT-1（RNAi）神经元的基因上调（紫色）和下调（绿色）。
3. BCAT-1（RNAi）线虫中TCA循环代谢产物的消耗
成年线虫喂食BCAT-1或对照RNAi，并在第5天采集数据，与对照组比较，BCAT-1（RNAi）线虫的特征显著改变（图3 A和B），偏最小二乘判别分析显示组间有明显的分离（图3C）。在BCAT-1（RNAi）线虫中，缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸降解以及丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢与支链氨基酸代谢有关（图3D），假定亮氨酸、异亮氨酸和谷氨酸的特征在bcat1（RNAi）线虫中分别增加和减少（图3E）。与转录组学分析一致，柠檬酸盐循环（TCA循环）显著改变（图3D）。虽然TCA循环基因的表达显著增加（图2F），但注释的TCA循环底物和前体丙酮酸/苹果酸和琥珀酰辅酶A/甲基丙二酰辅酶A的水平显著降低（图3F）。这些发现表明，BCAT-1基因敲除降低了TCA循环代谢产物的稳态水平，而糖酵解和TCA循环酶的表达增加。
图3 代谢组学分析揭示了BCAT-1（RNAi）线虫中TCA循环代谢产物的消耗
（A和B）曼哈顿图（A）和热图（B）显示BCAT-1（RNAi）线虫的特征增加（紫色）和减少（绿色）；（C）偏最小二乘判别分析；（D）使用mummichog算法的途径分析；（E）在BCAT-1（RNAi）线虫中，假定标注为亮氨酸/异亮氨酸和谷氨酸的特征分别增加和减少；（F）在BCAT-1（RNAi）线虫中，TCA循环代谢物/前体减少。
4. 低水平的TCA循环代谢物可能导致线粒体呼吸减少。
作者在第5天测定耗氧率（OCR）发现BCAT-1（RNAi）线虫的基础和最大呼吸速率都显著增加（图4A）。四甲基罗丹明乙酯（TMRE）染料检查多巴胺能神经元的线粒体功能发现表达α-突触核蛋白的多巴胺能神经元通过BCAT-1敲除增加了TMRE荧光强度（图4B）。由于线粒体呼吸产生活性氧，作者于第8天在α-突触核蛋白多巴胺能神经元中测定蛋白质羰基化水平。线粒体呼吸增加与最终羰基化蛋白水平的增加有关（图4C），表明BCAT-1的破坏导致神经元产生蛋白质损伤。为了进一步测试BCAT-1（RNAi）神经毒性是否需要增加线粒体呼吸，作者将线虫暴露于100μM叠氮钠中。结果表明叠氮处理的BCAT-1（RNAi）线虫的总活性水平（活性指数）与对照组相比没有差异，叠氮处理显著改善了BCAT-1（RNAi）线虫的运动功能（图4D）。此外，叠氮治疗减少了CEP多巴胺能神经元和轴突的退化（图4E），并恢复了BCAT-1（RNAi）线虫的基础慢化反应（图4F）。这些结果强烈表明线粒体过度活跃是BCAT-1相关PD表型的一个致病因素。
图4 BCAT-1（RNAi）的神经毒性取决于线粒体呼吸的增加，并与氧化损伤有关
（A）第5天，神经元RNAi敏感的BCAT-1（RNAi）线虫（CF512株）的线粒体呼吸增加；（B）第5天，表达CEPα-突触核蛋白的多巴胺能神经元的BCAT-1基因敲低，线粒体活性（通过TMRE荧光测量）增加；（C）在第8天，表达CEPα-突触核蛋白的多巴胺能神经元的BCAT-1敲除蛋白羰基化增加；（D）从第4天开始，用100μM叠氮化钠处理的BCAT-1（RNAi）线虫（CF512株）在第8天减少了卷曲运动功能障碍；（E）从第4天开始的叠氮化物处理可降低表达α-突触核蛋白的CEP多巴胺能细胞体（箭头）和神经突（箭头）的神经变性，并降低BCAT-1；（F）从第3天开始的叠氮化物治疗在多巴胺能神经元中表达α-突触核蛋白的BCAT-1（RNAi）线虫的第5天恢复了基础减慢。
5. 二甲双胍减少了BCAT-1（RNAi）线虫的神经变性并恢复了正常的线粒体呼吸水平
为了研究二甲双胍在BCAT-1（RNAi）PD线虫模型中的神经保护作用及其对线粒体的影响，作者采用了高通量药物筛选中建立的方法。神经RNAi敏感的线虫成年后喂养BCAT-1或对照RNAi，第4天转移到接种有热灭活的OP50大肠杆菌和50μM药物或载体（0.05%DMSO）的平板上（图5A）。暴露BCAT-1 RNAi至第4天，然后用热灭活细菌进行载体处理，在第8天产生显著的卷曲（图5A），用于认知症状的帕金森病药物没有效果（图5B）。为了确定二甲双胍是否能拯救多巴胺能神经元α-突触核蛋白表达的线虫的BCAT-1相关毒性，作者测量了运动功能和多巴胺神经元变性。用50μM二甲双胍处理的线虫在第8天表现出明显的卷曲减少（图5C）。在第8天，二甲双胍处理的BCAT-1（RNAi）线虫与载体处理的线虫相比，形态健康的多巴胺能细胞体和神经突起的数量增加（图5D）。第8天，二甲双胍治疗降低了对照组的基础和最大线粒体呼吸水平（图5E）。第6天使用TMRE染料检测发现二甲双胍治疗2天就可恢复BCAT-1（RNAi）线虫多巴胺能神经元表达α-突触核蛋白的正常线粒体活性水平（图5F）。
图5 二甲双胍减少了BCAT-1（RNAi）线虫的神经变性并恢复了正常的线粒体呼吸水平
（A）药物治疗的实验设计；（B）第8天，PD药物减少了BCAT-1（RNAi）线虫的卷曲；（C）二甲双胍在第8天减少了在多巴胺能神经元中表达α-突触核蛋白的BCAT-1（RNAi）线虫的卷曲；（D）在第8天测得的BCAT-1敲除降低了表达α-突触核蛋白的多巴胺能细胞体（箭头）和神经突（箭头）的神经变性；（E）在第8天，二甲双胍降低BCAT-1（RNAi）线虫（CF512株）线虫的线粒体基础呼吸。
6. 神经元BCAT-1的减少会增加线粒体呼吸诱导氧化损伤而导致神经退行性变
作者研究发现神经元BCAT-1的减少通过增加线粒体呼吸诱导氧化损伤而导致神经退行性变（图6）。BCAT-1的减少可导致TCA循环基因表达增加和TCA循环代谢产物消耗（图6B）。二甲双胍治疗能够恢复线粒体呼吸的正常水平，并可能通过抑制复合物I来挽救神经元的活力（图6C）。
图6 神经元BCAT-1的减少通过增加线粒体呼吸诱导氧化损伤而导致神经退行性变
（A）在健康的神经元中，BCAT-1通常在TCA周期中提供代谢输入，从而导致线粒体呼吸的正常水平。（B）随着BCAT-1的减少，TCA循环基因表达增加，TCA循环代谢物的稳态水平降低，这可能是由于更大的TCA循环更新。这导致线粒体呼吸增加和活性氧介导的损伤，最终导致神经变性。（C）二甲双胍治疗可能通过复杂I抑制来恢复线粒体的稳态并拯救神经元的活力。
讨论
作者研究发现2型糖尿病药物二甲双胍可恢复正常的线粒体呼吸水平，减少神经再生，并改善运动功能，即使在疾病发作后进行给药也是如此。这项工作为线粒体过度活跃导致PD表型异常的潜在机制提供了理论依据。同时，控制线粒体呼吸的减少也可作为PD的潜在治疗策略。