单细胞遗传筛查确定上皮-间充质转化连续体中的调控点

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单细胞转录组分析综述

单细胞入门-读一篇scRNA-seq综述

文章信息
今天介绍的文章于2019年9月2号发表在Nature Genetics，文章题目是：A pooled single-cell genetic screen identifies regulatory checkpoints in the continuum of the epithelial-to-mesenchymal transition

Abstract

于 breast cell 中研究EMT。描述了EMT整体的transcriptomics的动态过程；并通过CRISPR的screening找到其调控者（checkpoint genes），并用其inhibitor验证了这一发现。

Workflow

scRNA-seq:

  • MCF10A cells的outer edge向外migrate （spontaneous EMT）=> inner, outer cells 分别10X

  • 上述模型，treat cells with TGF-beta (TGF-beta driven EMT) => inner, outer cells 分别10X

  • 上述两个模型，加以induce Loss Of Function (LOF) 的sgRNA pool（一共16 surface receptors + 24 TFs）的cell mixture => inner, outer cells 分别10X

Results 

1. Pseudospatial trajectory reconstruction of spontaneous EMT reveals the transition as a continuum of epithelial–mesenchymal states

将 cells 按pseudospace排列（monocle）；说明model的reliability: inner & outer cells的确有Epithelial & Mesenchymal marker genes表达的区别 （inner更Epi, outer更Mes）

2. Pseudospatial trajectory alignment elucidates transforming growth factor β (TGF-β)-driven full EMT

比较spontaneous (Sp) & TGF-beta driven (Tg) 的EMT的不同

  • TGF-beta的确strongly prompt EMT in outer cells

  • 相同pseudospace位点的Sp和Tg也有很多不同

  • 上述的不同，具体体现于c中所示的各种oncogenic signatures：highlight KRAS在Tg中更激活

  • 总体显示Tg EMT是连续的trajectory，而并非之前FACs研究所显示的 3 state的过程

  • 与in vivo tumor进行比较：scoring （h); projection (i)

3. A pooled loss-of-function screen identifies genes regulating EMT progression

先说明模型valid：

  • 存在EMT受到阻滞的cells

  • TGFBR1/2的LOF (pos control)可以阻滞EMT

进一步找EMT的check point：比较sgRNA of certain genes和control sgRNA组：沿pseudospace分布的不同

  • 不同的genes使cells enrich在pseudospace的不同位点（即，EMT的不同stages）=> potential checkpoint genes

  • 在Ras/MAPK通路里，多个gene的LOF使cells stuck在不同的sites

  • 用Ras/MAPK下游（RAF/MEK/ERK pathway or PI3K/AKT pathway）的多个molecule的inhibitor，检测它们是否能block EMT

    • Highlight MEK pathway: MEK inhibition => 不影响gain in V，但阻止了loss in E. （in both Sp & Tg)

  • 测试了5种MEK pathway的upstream regulator（Receptor Tyrosine Kinase, RTK）：用药物测试了一些RTK & Integrins的inhibitors

    • Highlight EGFR: 但它的作用仅限于Sp而不适用于Tg

  • 于tumor data检验这些potential checkpoint genes

    • early blockers与EMT score负相关；但与上述MET等正相关

Comments 

  • 方法亮点：

    • scRNA-seq结合KO perturbation (high-throughput pooled Loss Of Functiion screening)：可以研究一个dynamical process中的checkpoint genes

    • 规矩的思路：先由data发现可能的通路 （找到KRAS)，再screen该通路的下游通路（找到MEK），再screen该通路的上游RTK inhibitor (EGFR; RTK是临床更常见的靶点)

  • 生物学发现：

    • KRAS的不同成分一贯始终地参与调节EMT的全过程

    • 无TGF-beta时，inhibit RAF/MEK/ERK 可以阻止loss in E & gain in V

    • 有TGF-beta促进EMT时，inhibit MEK sign只能阻止loss in E；因此cells呈现 E & V double positive的性状 （即，经典的partial-EMT)

  • Comp方法 (Monocle based，毕竟出自该组)

    • Pseudospatial construction

    • Extract genes that vary over trajectory

    • Aggregate gene expression scores (类似GSVA enrichment score)

    • Align two trajectories (Dynamic time warping)

    • Projection of scRNA-seq cells to a known trajectory （和已知trajectory的data做KNN）

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