iPOND技术

一、iPOND概述

iPOND(isolation of proteins on nascent DNA)指在新生的DNA上分离蛋白质，iPOND技术使我们能够将存在于新合成DNA的蛋白质以高的时间和空间分辨率分离出来。范德堡大学医学院的Sirbu及其同事开发了这项技术，并于2011年首次发表。它提供了一种在不受干扰的条件下，在DNA复制过程或复制后，研究DNA中蛋白质动态的方法。具体过程如下图。

1. 制造一些诱饵----EdU标记复制的DNA

iPOND依赖于从细胞大量的DNA中识别出新复制的DNA的能力。这里的技巧是迫使细胞在DNA合成过程中加入与内源性稍有不同的胸腺嘧啶脱氧核糖核苷。

哺乳动物细胞可以吸收和磷酸化胸苷类似物5-ethynyl-2’-deoxyuridine (EdU)，这允许在DNA合成过程中，EdU合并代替胸苷。通过这种方式，EdU有效地标记了正在合成的DNA，而胸苷类似物在细胞培养基中出现。

2. DNA和蛋白质交联，生物素化

用EdU脉冲后，细胞通过甲醛处理固定。甲醛是一种交联剂，共价连接蛋白质-DNA复合物，有效地阻止DNA复制。

随着所有的DNA和蛋白质复合物被固定，生物素附着在已经合并入新生DNA的EdU上。 EdU包含一个亚烃基功能团，可以通过铜催化的环加成反应共价连接到叠氮化生物素。生物素-EdU一旦形成，我们就可以准备从细胞中提取出我们的交联DNA-蛋白复合物。

3. 拉下DNA关联蛋白

iPOND的下一步程序是超声处理裂解细胞。超声波的作用剪断DNA，减少背景信号，DNA和蛋白质将在整个基因组交叉连接。但是剪切的DNA片段将会是生物素- EdU标记或非标记。通过这种方式，我们可以特别地找出当EdU存在时复制的DNA片段。

在裂解物中加入链霉亲和素包被的磁珠，过夜孵育。一部分带有EdU-DNA的生物素，将会结合磁珠，具有很高的亲和力。蛋白质与DNA是交联的，这意味着非特异性蛋白将会被洗掉。

4. 蛋白质分析

DNA -蛋白质的交连被逆转，通过在变性缓冲液中煮沸， 蛋白质脱离链霉亲和素磁珠。

如果你知道你在寻找什么，你可以继续，并针对你的目的蛋白进行western blot。iPOND样品可以进行质谱分析，从而对蛋白质进行无偏差检测和定量，甚至翻译后修饰(PTMs)。 2013年，Sirbu, Lopez-Contreras和他们的同事们首次使用iPOND耦合到质谱技术来识别超过100种在复制叉上特别丰富的蛋白质。

二、你想要获取什么样的蛋白？---不同的实验设计

1.复制叉及其后面有哪些蛋白质----改变EdU 脉冲的长度

EdU存在时，细胞培养的时间越长，更多的DNA将被复制，更长的DNA被标记。这意味着，与EdU孵化时间很短将导致包含活跃合成DNA的蛋白质的样本。较长的孵育期将产生含有这些蛋白质的样本，以及遗留在活性复制叉之后和其他与新生DNA结合的蛋白质。

与EdU2.5分的钟孵化足以检测活跃复制叉的组分。如果考虑到EdU扩散速度，磷酸化和DNA合成速度，估计iPOND的分辨率为DNA 1到2kb之间。

2. 在成熟的染色质中有哪些蛋白质?-----EdU 脉冲追踪

也许你对DNA合成并不感兴趣，也许你更感兴趣的是DNA被复制后DNA -蛋白环境是如何建立的，也可以通过调整你的DNA诱饵来进行。

在这种情况下，你可以做一个脉冲追踪实验。这涉及到先与EdU孵育脉冲细胞，然后通过添加过量的胸苷来追踪。通过这种方式，被EdU标记的DNA被留在向前移动的复制叉后面。

目前在被EdU标记的DNA中存在的蛋白质将参与建立染色质，处理DNA复制错误或绕过损伤而不是合成DNA。哥本哈根大学的Alabert和他的同事们采用了这种方法来研究新生的染色质和成熟的染色质之间的差异，这种技术与iPOND非常相似，他们称之为新生的染色质捕获(nascent chromatin capture, NCC)。

3. 扰动复制分叉中存在哪些蛋白质----具有挑战性的DNA复制

你可以在影响DNA合成或损害DNA的药物存在的情况下使用EdU脉冲细胞。在这个设置中，你可以研究当复制叉不能正常地继续或当它遇到特定的DNA损伤时，会出现哪些蛋白质。

你也可以在特定蛋白质或进程的功能抑制剂存在时进行实验，或者是那些有你最喜欢的基因突变或删除的细胞，你可以研究你的进程或目的基因对DNA合成中的蛋白质的影响。

原则上，每一个涉及DNA合成的细胞过程都可以用iPOND技术来研究。

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