科研 | Environmental microbiology：细胞宏基因组揭示了深淡水湖中潜在的关键病毒-宿主相互作用
编译：Jione、song，编辑：小菌菌、江舜尧。
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自从发现大量病毒存在于水生系统以来，人们对病毒生态学的理解得到了迅猛的增长。病毒感染细菌和古细菌的过程已经被广泛研究，因为它们在生态系统中发挥着重要作用。病毒通过将宿主的细胞内容物释放到环境，并携带宿主衍生的代谢基因（辅助代谢基因，AMG），改变宿主的新陈代谢以达到促进病毒繁殖的目的，最终将微生物网重置。尽管淡水生态系统占据地球表面的小部分，但这些地区每年在全球范围内循环的碳量占据较大份额，且作为饮用水资源，对人类至关重要。
研究人员为了解淡水中关键病毒-宿主的相互作用，在淡水湖的两个水层进行了持续9个月的取样，随后将样品进行分级过滤，以获取细胞（0.22-5.0μm）和病毒粒子（<0.22μm）。然后，提取了两种样品的DNA并进行基因组文库构建，使用Illumina MiSeq进行测序。从病毒体的11个装配体和细胞的7个装配体中提取的病毒重叠群，通过BLASTn对获得的8137个重叠群进行冗余检查，并通过检查病毒标记基因进一步纯化重叠群，使用Prodigal预测了重叠群上的开放阅读框（ORF），并进行了功能注释。使用MetaBAT进行原核基因组的分装，并计算每个样品中LBMAG的相对丰度。从病毒宿主数据库中提取2621个分离的dsDNA，制备RVG，进行参考数据库的构建，绘制淡水浮游细菌基因组的系统发育树，并进行系统发育分配，使用GTDB-Tk进行确认。接下来，计算SG蛋白量并进行蛋白组树的构建，通过计算机组合分析预测每个LBVG的宿主。
结果显示，感染放线菌的病毒具有很高的遗传多样性和感染裂解率，且放线菌是淡水系统中最丰富的浮游细菌门之一，还发现了一些新的病毒宿主，这些宿主涉及其他主要的淡水浮游细菌谱系，如淡水分支的SAR11谱系和MGI氨氧化古菌。本研究揭示了新的病毒-宿主对的生命周期，并提供了病毒-宿主相互作用的生态学含义，确定了几种常见的病毒辅助代谢基因存在于海洋系统中。
论文ID
原名：Genome-resolved viral and cellular metagenomes revealed potential key virus-host interactions in a deep freshwater lake
译名：基因组解析的病毒和细胞宏基因组揭示了深淡水湖中潜在的关键病毒-宿主相互作用
期刊：Environmental microbiology
IF：5.147
发表时间：2019.10
通讯作者：Yusuke Okazaki
通讯作者单位：京都大学生态研究中心＆生物生产研究所、国家先进工业科学技术研究院
实验设计
结果
1 样本和程序集概述
亚基因组测序以及随后的组装（表S2）、净化和解除复制步骤最终产生4158个大于10 kb的病毒片段，包括183个完整基因组（图S1）。183个lbvgs的gc含量范围为29.1-66.7％，除lbvg 1（318kb）和lbvg 2（190kb）（图1a）在已知的原核dsDNA范围内，所有基因组大小均小于120kb。
利用sg评估病毒基因组之间的相似性。先前的研究表明SG>0.15是病毒基因组属级聚类的最佳阈值。参考这个阈值，183个lbvg被分成28个基因组操作分类单元，每个单元包含2-10个lbvg，剩下90个lbvg未分组（图2）。利用sg>0.15的阈值，发现4个（2.2%）和127个（69.4%）lbvg分别在rvg和evg中有属级关系（图2）。一个基于sg的蛋白质组树，包括所有lbvg和evg以及基因组之间的比对。
从细胞部分组装的片段的亚基因组组合恢复了57个浮游细菌的亚基因组组合基因组。这些基因组中有45个（78.9%）是高质量的，完整性和污染分数分别大于80%和小于5%（表S3）。与之前的结果一致，一个深度分层的浮游细菌群落表层以LD12、放线菌和蓝藻为主，而下层以CL500-11和假丝酵母为主。对于一些谱系（如ld12、ld28和opb56），表层和下层中组装出不同的基因组，表明水层之间存在微多样化。
图1 组装的病毒基因组和重叠基因组的概况
图2 183个LBVG的蛋白质组树和分析结果
图3 基于利用PhyloPhlAn软件选择的保守单拷贝基因的宏基因组组装
2 病毒群落的时空动态
前边缘和后边缘特异性病毒谱系明显分离（图1b，c）。183例lbvg中，60例为上皮细胞特异性，62例为低边缘细胞特异性，上皮细胞低边缘细胞偏好（pepi）值分别大于95%和小于5%。NMDS分析进一步证明了分层期间病毒群落的垂直分离（图4）。
与上层群落（0.54-0.68）相比，深水层的病毒群落总体稳定（图4和5）。在低层环境中，许多病毒系持续占据主导地位超过一个月（图5）。
除了深水层中病毒群落的整体稳定性外，病毒体部分还观察到了两个动态群落变化（图4和图5），第一个转变可能是由几种病毒从溶源性转变为裂解引起的。在细胞级分中，LBVG_87是9月最丰富的LBVG，但其丰度在10月突然下降，而其病毒体级分的丰度同期增长了120倍，使LBVG_87成为最丰富的浮游生物（图5，S4和图S5）。同样，从9月到10月，病毒体部分中LBVG_111和LBVG_121的相对丰度分别增加了1800倍和38倍，这可能是由于9月诱导了丰富的细胞内病毒引起的（图5，S4和S5）。宿主在水层之间未观察到细胞毒粒偏好（Pcell）的差异（图S6）。因此，尽管在该层中没有清楚地观察到时间趋势，但是溶解和诱导也可能在变温层中比较常见，这可能是由于上层病毒体群落的快速演替（图4和图5）。
图4 非度量多维标度（NMDS）分析显示样本之间病毒群落的差异
图5 每个样品中10个最丰富的病毒基因组
3 可能的代谢重组宿主的病毒抗体
功能注释显示，LBVG编码先前在海洋病毒体中已鉴定出的AMG。LBVG_55是寄主不明的低层动物中的主要病毒之一（图5），其编码的钴胺素的生物合成中涉及基因（cobS和cobT），而细菌基因组中通常不存在这种基因。几个LBVG包含一个与脂多糖（LPS）和荚膜多糖生物合成有关的基因簇。腺苷酸硫酸激酶（CysC）和3'-磷酸腺苷5'-磷酸硫酸盐（PAPS）还原酶（CysH）家族中的蛋白质分别在4个和17个LBVG中编码，并且LBVG_98包含两者。这些基因存在于病毒基因组中，表明它们在生态系统中具有重要的定量意义。
4 病毒感染主要浮游细菌的生态作用
病毒感染优势浮游细菌的生态作用，通过同时重建的浮游细菌基因组（LBMAG）体现。预测宿主有40个LBVG，且预测的宿主跨越10个门（或变形杆菌属；图3），并且6个LBVG的宿主可以进一步解析到属水平。鉴定出了13种感染放线菌的LBVG，放线菌是淡水浮游生物中种类最多，数量最多和最普遍的群体之一。除LBVG_68（基因组大小= 40.0 kb）外，所有放线病毒LBVG均具有小的基因组（14.0-19.8 kb），并形成了由四个gOTU（gOTU_8，gOTU_13，gOTU_14和gOTU_28；图2）组成的单系进化枝。EVG在内的蛋白质组都与源自其他淡水系统的相同大小的病毒基因组密切相关（图6和补充比对S1）。gOTU_28的成员与G4噬菌体（uvFW-CGR-AMDFOS-S50-C341）同属（图6），LBVG中不存在其他三个西班牙放线病毒组（G1，G2和G3），但在从其他淡水湖中回收的LBVC（图S7）和EVG中可观察到（补充比对S2-4）。结果显示这些病毒群在淡水系统中无处不在，且GC含量范围很广（41.6–62.6％），表明它们的宿主包括放线菌的不同成员，具有很大的GC含量（表S3）。在上层动物中，LBVG_179连续占主导地位，其他放线病毒成员在细胞和病毒颗粒部分中也很丰富（图5和S8）。尽管9月以后的在变温层中没有获得数据，但是在混合期开始后病毒体在病毒体组分中占主导地位，这表明它们在变温层水中一直占主导地位，直到分层期结束。结果表明，放线菌病毒的不同成员主动复制和裂解宿主细胞从而在上附着物中产生病毒体。放线菌病毒是淡水系统中种类最多，数量最多，普遍存在且活跃的病毒组之一。
在整个研究期间，LD12是迄今为止最丰富的LBMAG。与放线菌病毒不同，三种预测的LD12病毒没有与其他LBVG聚集（图2），它们的基因组多样性似乎有限，反映了LD12细菌也显示出有限的基因组多样性。LBVG_1的上膜细胞部分丰富，而病毒颗粒部分则很少（图5和S8）。相比之下，其他两种预测的LD12病毒（LBVG_76和LBVG_174）在细胞级和病毒体级分中均很丰富（图5和S8），表明这些病毒正在积极复制和裂解其宿主。结果表明，按照其海洋对应物，病毒是LD12种群动态的重要驱动因素，LD12是淡水微生物生态系统中数量最重要的组成部分之一。
LBVG_51主要在次纤毛的细胞部分中检测到（图5和S8），表明在研究期间它们在细胞内。尽管病毒（LBVG_51）和宿主的相对丰度在分层期间均表现出持续增加趋势，但病毒丰度的增长速度却不成比例（从9月到12月为48.3倍）。
图6 确定的五个放线菌群及其在环境病毒基因组(EVG)数据库中的亲缘关系
5 病毒基因组多样化的栖息地
大多数LBVG（183个中的116个）与从其他淡水环境中回收的基因组密切相关（图2），表明它们属于普遍存在的淡水病毒谱系。这些谱系中的一部分表现出非常高的湖间基因组相似性。
研究人员还发现34种与海洋病毒基因组相似（SG> 0.15）的LBVG（图2）。gOTU_26（LBVG_135和LBVG_162）是宿主身份不明的次绒毛虫中的优势病毒之一（图5），具有保守的基因组结构，其病毒基因组来自广泛的水生生境，如地中海，太平洋，大西洋，阿拉伯海，大阪湾，奈湖和索阳湖的表层和深水区（补充路线S6）。在病毒S-EIV1、LBVG_9的成员中，观察到海洋和淡水病毒基因组之间的最大相似性，其相似性得分（SG = 0.52）比其他物种高。
讨论
从6月到12月观察到了热分层现象，低钙离子始终处于氧化状态，溶解氧浓度大于6.0 mg。亚基因组测序以及随后的组装、净化和解除复制步骤最终产生4158个大于10 kb的病毒序列，包括183个完整（即圆形）基因组。183个lbvgs的gc含量范围为29.1-66.7％，除lbvg 1（318kb）和lbvg 2（190kb）在已知的原核dsdna病毒基因组范围内，所有基因组大小均小于120kb。
在低层环境中，许多病毒谱系持续占据主导地位超过一个月。值得注意的是，浮游生物的腐烂率范围为0.14至54％，这意味着水柱中的大多数病毒体都在一个月内翻转。此外，最近在海洋系统研究表明，大多数经宏基因组学检测到的病毒在24小时内具有转录活性。因此，某些病毒谱系在低血脂素中的持续优势可能是由于病毒体的连续生产而不是其结转超过一个月。这种模式可能是由于在次纤毛中浮游细菌的产量降低，导致病毒裂解周期延长。为了证明这一点，在琵琶湖的研究估计，次上层动物（0.4±0.1 µg C l-1 d-1）的细菌产量比上层动物（4.2±3.2 µg C l-1 d-）低10倍。次上层病毒（13.6±5.2％）的病毒每天损失的细菌产量百分比比上层动物（52.7±16.2％）低4倍。
由于在其基因组中未发现整合酶基因，因此它们可能以染色体外或假基因的方式存在于宿主细胞中。pH、温度、养分、氧化应激和太阳辐射等环境胁迫可触发溶菌诱导。虽然分层期间的次生水滑石比上生水滑石在物理化学上更稳定，但生物学因素（例如，来自上生水滑石的浮游植物浮沉的脉冲）可能导致了每月规模的环境变化并触发了在均温层中的感应。宿主的细胞丰度增加或生理状况改善也可以触发诱导，一旦宿主在环境中成功定殖，病毒就充当“定时炸弹”并破坏与宿主的共生关系。宿主在水层之间未观察到细胞毒粒偏好的差异（图S6）。
病毒AMG可能对宿主进行代谢重编程病毒基因的功能注释（补充数据集S1）显示，LBVG编码先前在海洋病毒体中已鉴定出的AMG。例如，两种蓝细菌病毒（LBVG_2和LBVG_12）带有光系统II D1蛋白（psbA）基因，该基因可加快宿主的光合光反应速率，促进病毒繁殖。LBVG_55是寄主不明的低层动物中的主要病毒之一（图5），其编码的钴胺素的生物合成中涉及基因（cobS和cobT），而细菌基因组中通常不存在这种基因，从而限制了它们的代谢能力。几个LBVG包含一个与脂多糖（LPS）和荚膜多糖生物合成有关的基因簇。腺苷酸硫酸激酶（CysC）和3'-磷酸腺苷5'-磷酸硫酸盐（PAPS）还原酶（CysH）家族中的蛋白质分别在4个和17个LBVG中编码，并且LBVG_98包含两者（补充数据集S1）。这些基因参与同化硫酸盐的还原，并可能促进宿主利用还原的硫化合物。这些基因存在于无处不在，表明它们在生态系统中具有重要的定量意义。相比之下，这些基因在海洋生态系统中没有被报道为常见的AMG。鉴于淡水系统是硫受限的，并且许多主要的淡水浮游细菌谱系（例如LD12，acI-B1）的基因组，和CL500-11缺乏同化硫酸盐还原的完整途径，这些病毒编码的基因可能是调节湖中微生物硫代谢的关键因素。
鉴于放线菌的盛行，唤起了KoM假说，该假说旨在解释海洋杆菌及其病毒的共性。在KoM假设中，宿主物种在高病毒裂解压力下的优势为宿主提供了更大的机会，可通过基因组重组获得对病毒感染的抗性，这为宿主繁殖产生了正反馈调节。最具代表性的淡水放线菌谱系acI的单细胞扩增基因组显示出高种群内多样性，证实了这一假说，表明acI成员具有很高的重组率。另一项研究表明，acI谱系成员通常怀有包含可能与病毒宿主识别有关的基因的基因组岛，即使在密切相关的菌株中（平均核苷酸同一性[ANI]> 97％）。因此，本研究中最紧密相关的一对放线病毒LBVG显示出尾部相关基因的多样性，这些基因通常参与病毒识别（补充比对S1）。此外，简化的acI基因组不包含CRISPR-Cas系统，并且最近在琵琶湖进行的原表观基因组学分析表明，放线菌的基因组既缺乏甲基化DNA又没有甲基转移酶基因，这表明它们缺乏抵抗病毒感染的限制性修饰系统。放线菌病毒的高丰度和多样性可能是与宿主进行竞争而导致的，从而导致宿主的基因组多样化，从而避免了高病毒载量导致的死亡率。实际上，有109个LBVC编码了放线病毒标志whiB基因，表明大多数放线病毒基因组并未以LBVG的形式回收。结果表明，与其宿主相似，放线菌病毒是淡水系统中种类最多，数量最多，普遍存在且活跃的病毒组之一。
在海洋系统中，MGI的成员在无水层中也占主导地位，包括编码AMG。第一个淡水MGI病毒与已知的海洋MGI病毒或EVG数据库中的任何基因组均未显示出基因组相似性。基因组编码RadA样ATP酶，复制蛋白A和微染色体维持解旋酶基因，它们驱动古细菌DNA复制系统，大概是促进宿主中病毒基因组的复制。LBVG_51主要在次纤毛的细胞部分中检测到（图5和S8），表明它们在细胞内。尽管病毒（LBVG_51）和宿主的相对丰度在分层期间均表现出低速度的持续增加趋势，但病毒丰度的增长速度却不成比例（从9月到12月为48.3倍）。LBVG_51基因组中没有注释整合酶基因。总的来说，假设LBVG_51基因组是使用病毒基因组上编码的复制机制在宿主细胞内进行染色体外复制的。一个不完全重叠群，LVBC_1935（16737 bp），也可能是从Ca衍生而来的。亚硝基古细菌病毒，显示出与Ca相对应的GC含量和时空分布。预测会感染其他浮游生物类群的病毒，例如蓝细菌、拟杆菌、β变形杆菌、γ变形杆菌、硝化螺旋藻、浮游菌和疣状微生物菌（图2和3）。
多数LBVG（183个中的116个）与从其他淡水生境中回收的基因组密切相关（图2），表明它们属于普遍存在的淡水病毒谱系。这些谱系中的一些谱系表现出非常高的湖间基因组相似性。例如，在放线菌病毒（图6）LBVG_182和3300002835.a_100013722中，从美国门多塔湖检索到的基因组的SG值为0.76，ANI值为84％。尽管从海洋环境报告了几乎相同的病毒基因组，但由于湖泊和水库实际上是与自然环境隔离的，这些结果在淡水系统中令人着迷。相比之下，居住在不同淡水系统中的宿主（即浮游细菌）的基因组通常是不同的，尽管偶尔在不同大陆的湖泊中也报告了高度相似的基因组（ANI> 95％）。病毒在植物学上的高连通性大概是因为由于本地宿主缺乏免疫力，病毒很容易在新的栖息地定殖，而细菌的定殖通常受到优先作用的限制。
结论
基因组学极大地扩展了已知的病毒圈，但淡水病毒的多样性及其与宿主的生态相互作用仍然知之甚少。研究人员通过对从深淡水湖（日本琵琶湖）时空采集的病毒离子（<0.22μm）和细胞（0.22-5.0μm）片段进行测序，对浮游dsDNA进行了亚基因组研究。同时重建了183个完整（即圆形）病毒基因组和57个浮游细菌基因组集合基因组。对亚基因组阅读覆盖率的分析显示，病毒群落的垂直划分类似于垂直分层的浮游细菌群落。低湖沼群落在分层过程中基本稳定，但偶尔会突然改变。20个病毒基因组（包括显性病毒基因组）中编码了参与同化硫酸盐还原的基因，有助于硫限制性淡水系统中的病毒繁殖。寄主被预测为40个病毒基因组，包括10个门（或蛋白质细菌类）和淡水浮游细菌谱系。建立了一个基因组解析的病毒多样性的综述，并描述了淡水生态系统中潜在的关键生态角色。
评论
本研究的独特性和优势在于研究人员对深淡水湖中的细胞（0.2-5μm）和病毒（0.2μm以下）基因组进行了时空取样和同时测序。这揭示了单个病毒谱系的丰度和生命周期，包括细胞内和细胞外阶段。研究结果描述了新的病毒-宿主对，而且揭示了它们的生命周期，并提供了病毒-宿主相互作用的生态学含义，为阐明病毒的迁移和进化过程提供了基础。
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