科研 | PNAS: 真菌和植物病毒之间的促进和协同作用(国人作品)
编译：阿昊，编辑：小菌菌、江舜尧。
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植物和真菌通过双向交换细胞内容物产生密切联系。最近，一种植物病毒被证明可以从植物传播到真菌，但真菌病毒是否也能跨越宿主屏障传播到植物中还不清楚。
在本研究中，我们调查了一种真菌病毒-板栗疫病菌低毒病毒(CHV1)的传染性。机械摩擦接种后，CHV1可以在叶片进行复制，但没有在全身进行扩散。但和烟草花叶病毒（TMV）等其他RNA病毒一同接种后，CHV1会进入到植物体内。类似的，CHV1感染会增加植株对TMV转运蛋白的表达，同时接种TMV转运蛋白会进一步增强CHV1在植物体内的富集。另一方面，当TMV被接种至一种植物病原真菌（赤霉病菌）后，CHV1感染增加了TMV的积累。在禾本科接种试验中，我们发现无论是植株还是真菌接种TMV，都会激活CHV1从真菌向植株水平转移，而CHV1的感染也会强化真菌吸收TMV。我们的结果证明了植物和真菌病毒之间促进跨界病毒感染的双向促进作用，并提示在自然界中存在植物真菌介导的真菌和植物病毒传播途径。
论文ID
原名：Facilitative and synergistic interactions between fungal and plant viruses
译名：真菌和植物病毒之间的促进和协同作用
期刊：PNAS
IF：8.58
发表时间：2020（Available Online）
通讯作者：孙丽英
作者单位：西北农林科技大学
实验设计
1.真菌、病毒、质粒和植物材料
2.RNA提取，RT-PCR, RNA印迹分析
使用TRIzol提取叶片总RNA。在含有100mM Tris/HCl (pH 8.0)、200mM NaCl、4mM EDTA、4% SDS的缓冲液中，用苯酚/氯仿萃取法从感染病毒的真菌菌丝中提取总RNA，然后用RQ1 DNase I处理，消除真菌DNA。RNA印记分析如前人研究所述，印迹与digoxigenin (DIG, Roche Diagnostics)标记的针对CHV1 (ORF B中p48区域区域)(图1A)、TMV (CP基因)、PVX (CP基因)、PVY (CP基因)、CMV (MP基因)的RNA探针杂交。杂交条件和病毒rna检测按照罗氏公司提供的DIG应用手册进行。利用化学发光计(Clinx科学仪器公司)显示化学发光信号。在整个研究过程中进行的实验至少重复两次。
3.为植物接种病毒
植物接种病毒的过程是人工摩擦接种。将感染CHV1病毒真菌的总RNA提取物使用碳化硅粉末机械摩擦到植物叶片上。为了促进CHV1在植物中的传播，烟草叶片首先与植物病毒mv、PVX、PVY或CMV进行机械摩擦接种，每个实验至少接种30株植物。病毒感染随后经RT-PCR证实。
结果与讨论
1 与植物病毒共感染可使植物内的CHV1发生全身性感染
前人的研究显示真菌病毒可以在植物细胞中进行复制，但是真菌病毒感染整个植物的能力没有被证明。为了研究这一问题，我们选择了CHV1人工接种烟草植株(图1A, CHV1野生型(WT))，RNA病毒在接种后的1-7天可以被检测到，但直至7-14天，在没有接种的叶片上RNA病毒不能被检测到。为了确定CHV1在接种叶片上的复制情况，在1，3，5天检测基因组中的RNA，但只有在第三天被检测到。此外，当接种CHV1浓度较低时，接种叶片中CHV1 的基因组RNA的积累量也较少。因此，接种高浓度的真菌可能可以感染大量的细胞。一个平行试验也证明了这一点。总之，这些结果表明，CHV1在接种的叶片中复制，但不系统地扩散到上部叶片(图1B)。
图1 N. tabacum 植株的CHV1感染
2 TMV感染增强了CHV1在植物体内的积累
CHV1 的可读框 A编码为p69，这是一种多蛋白，可被水解为p29和p40(图1a)。尽管植物体内基因组RNA下降，但P69的突变体（CHV1-△P69）保持了复制能力，我们对比了CHV1-△P69和CHV1-△P29的致病能力，在未接种病毒的叶片和接种病毒的叶片上最终都检测到了RNA病毒。然而，CHV1-△P29显著低于CHV1-WT。因此，尽管p69对于CHV1在真菌内复制是非必要的，因此，但它对于CHV1在植物中的复制和/或积累却是必不可少的。
3 CHV1感染增强真菌TMV积累
植物与真菌病毒在植物体内的协同作用促使我们探讨真菌系统中是否也存在这种相互作用。我们使用赤霉菌进行这项研究，因为我们最初发现该真菌是CHV1和TMV的兼容宿主。因此，通过原生质体转染将TMV、CHV1和CHV1突变体导入赤霉菌。经真菌生长和产孢后，CHV1和TMV均通过无性孢子(分生孢子)垂直传播，与CHV1共感染增强了TMV垂直传播。此外，感染CHV1，但未感染CHV1突变体或TMV，降低了赤霉菌在马铃薯葡萄糖琼脂上的菌丝生长。赤霉菌中TMV-RNA的积累相对较低，可以通过RT-PCR检测(图2B)，但不能通过RNA印迹检测(图2C)。值得注意的是，与CHV1共感染显著提高了TMV RNA的积累(图2C)，而CHV1 RNA的积累不受与TMV共感染的影响(图2D)。此外，TMV外壳蛋白(CP)在单独转染TMV的真菌中没有被检测到。因此，CHV1对革兰草的TMV复制和/或积累具有单向协同作用。
4 一种RNA沉默机制抑制真菌中TMV的积累。
RNA沉默机制已被证明可以作用于真菌中的真菌病毒和类病毒，因此我们研究了类似的机制是否影响真菌中的植物病毒感染。Dicer-like (DCL)蛋白是RNA沉默途径中的关键成分之一，通过产生小干扰蛋白发挥作用。子囊菌真菌共编码两个dcl基因，dcl1和dcl2。为了解析这些基因的影响，通过接种dcl基因敲除突变体(Δdcl1和Δdcl2)来揭示烟草花叶病毒通过原生质体转染赤霉菌的原因。通过RNA 印记法和qRT-PCR分析TMV RNA的积累表明，尽管DCL2的作用似乎比DCL1更明显，但两种DCL蛋白均可抑制TMV的积累，并且DCL基因的缺失均可显著增强TMV的积聚(Fig.2I)。这些结果表明，RNA沉默对赤霉菌中TMV复制的抑制具有实质性的作用，这一发现与我们之前的观察一致，即CHV1 p29的沉默抑制活性是赤霉菌中TMV积累的协同效应的原因(图2G)。
5 植物病毒感染促进了CHV1从真菌到植物的转化
6 CHV1感染提高了TMV从植物向真菌的传播效率。
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