C57BL/6小鼠骨髓间质干细胞的复苏和培养

骨髓间充质干细胞是一种能分化为成骨细胞、脂肪细胞和软骨细胞的多能干细胞。因其具有强大的增殖能力和免疫调节功能，故被广泛应用于组织工程，细胞治疗和基因治疗。

取自C57BL/6小鼠骨髓，用C57BL/6小鼠间质干细胞完全培养基贴壁培养，传代扩增至第六代冻存，每支含细胞1×106个。

C57BL/6小鼠骨髓间质干细胞的复苏和培养

1. 水浴锅37°C预热。

2. 准备好C57BL/6小鼠骨髓间质干细胞完全培养基，温浴到37°C。

3. 取15 mL离心管中加入9 mL的完全培养基。

4. 从液氮中取出冻存的骨髓间质干细胞，立即放入-80°C冰箱（目的是让进入冻存管

的液氮挥发）。

5. 在-80°C放置2~3 min后，取出冻存细胞，将冻存管迅速放入37°C温水中，快速晃

动使管中内含物尽快融化。仔细观察，待冻存管内含物完全融化后取出。

注意：

• 尽可能避免水没过管帽，以减少污染的风险。

• 要快速完成细胞复苏过程，融化过程时间过长，会造成复苏后的细胞活性较差。

6. 用70%~75%的酒精擦拭消毒冻存管口的外表面。

7. 在超净台中打开冻存管，用吸管将细胞冻存悬液移入装有9 mL完全培养基的15

mL离心管中。注意尽量避免产生气泡。

8. 为了减少细胞损失，往冻存管中加入1 mL完全培养基，稍微吹打，收集至离心管

中。

9. 将细胞悬液经250 ×g（对应于Eppendorf 5810R离心机是1134 rpm）离心5 min。

10. 离心后尽量去除上清液，加入1~2 mL的完全培养基（已预热到37°C），轻轻吹打

混匀细胞沉淀。

11. 将细胞全部接种到1个T25培养瓶或底面积相当的培养器皿中，加入足量的完全培

养基。轻轻摇晃细胞培养器皿使细胞均匀分布。

12. 放入37°C、5%CO2、饱和湿度的培养箱中培养。

13. 复苏后的第2天，给复苏的细胞换用新鲜的完全培养基（已预热到37°C）。

14. 之后，每2天给细胞换新鲜的完全培养基直到细胞达80%~90%的汇合度。

15. 当细胞达80%~90%的汇合度，进行消化传代。

注意：为避免反复温热培养基，如果在一次操作中无法用完整瓶培养基，建议分装到

适当的无菌容器中。换液时只取当天所需用量的培养基进行预热。