编译：Yves，编辑：谢衣、江舜尧。
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导读
蛋白质与代谢产物(PMI)之间的特异性相互作用与许多细胞过程密切相关，在信号转导、调节物质和能量代谢中起着至关重要的作用。然而，现有的PMIs分析策略大多涉及代谢物的化学修饰或蛋白质的固定化，这使得目前PMIs的研究主要局限于脂质-蛋白质和疏水代谢物。在这项工作中，建立了一种无标记的在线动力学尺寸排除色谱-质谱(KSEC-MS)方法，并结合非靶向代谢组学来确定复杂体系中的PMIs。将代谢物混合物和目的蛋白依次进入SEC柱，无需预孵育，用全谱代谢物图谱和质谱监测KSEC的分离结果。如果目标蛋白影响代谢产物混合物中的潜在配体的迁移模式，则可以发现潜在的配体，并且这种变化与目标蛋白的浓度呈正相关。为了验证这一方法，首先选择碳酸酐酶（CA）作为测试蛋白，并成功地定义了乙酰唑胺作为其已知的抑制剂。此外，选择作为代谢物的共同运输载体的人血清白蛋白(HSA)作为目标蛋白，验证了该方法的有效性。从人血清中提取的代谢物中同时定义了多种内源性HSA配体，其中大部分是极性代谢物，而不是非极性脂质。这种方法可以提供一种新的方法来定位和识别复杂体系中的未知PMI，特别是极性代谢物与蛋白质的相互作用。
原名：UntargetedDefining Protein-Metabolites Interaction based on Label-free KineticSize-Exclusion Chromatography-Mass Spectrometry
译名：基于无标记动力学尺寸排除色谱-质谱法的非靶向限定蛋白质-代谢物相互作用
期刊：AnalyticalChemistry
IF：6.35
发表时间：2020.05
通讯作者：许国旺
通讯作者单位：中国科学院大连化学物理研究所分析化学分离科学重点实验室
KSEC的核心机理是基于蛋白质和代谢物在SEC柱中迁移速率的显著差异。在具体的实验过程中，采用塞式进样方式，而不是预先混合，将代谢物混合物和目标蛋白依次进样到SEC柱中。不同分子在SEC柱中的迁移模式如图1A所示。在初始时刻T0，将代谢物混合物的短塞注入SEC柱。在短时间间隔之后，在时间T1将另一短塞目标蛋白注入SEC柱中，以避免在注射过程中混合两个短塞。因为蛋白质在SEC柱中的迁移速度比代谢物快，所以目标蛋白在T2和T3时追逐并最终通过代谢物的区域。在这个过程中，蛋白质与其配体相互作用形成蛋白质-代谢物复合物。由于游离蛋白质和蛋白质-代谢物复合物的分子尺寸相差不大，它们在SEC柱上共同迁移。当游离蛋白和蛋白-代谢物复合物超过游离代谢物复合物时，蛋白-代谢物复合物开始不断游离，并在游离蛋白和蛋白-代谢物复合物区域之后产生代谢产物的踪迹。因此，如果一个代谢物是目标蛋白的配体，它在SEC柱上的理论迁移模式应该类似于图1B。当利用在线质谱检测来实时监测KSEC的分离结果时，洗脱的理论质量响应应如图1C所示。由于所定义的质谱参数不适合检测游离蛋白质和蛋白质-代谢物复合物，蛋白质-代谢物复合物在电离过程中被破坏并解离为游离蛋白质和代谢物。因此，首先可以用质谱检测和定量代谢物的结合分数，之后，出现一个趋势严重的色谱峰，对应于代谢物从蛋白质-代谢物复合物及其游离部分连续解离出来的代谢物。值得注意的是，迁移模式的变异程度与目的蛋白的浓度呈正相关。相反，如果一种代谢物不是目标蛋白的配体，它的色谱保留不会受到该蛋白的影响(图1D)。因此，其典型的萃取离子色谱图(EIC)仅由一个正常峰组成(图1E)。基于上述原理，利用非靶向代谢组学的方法，可以从一个复杂的系统中进一步定义和同时鉴定靶蛋白的多个配体，从而帮助我们发现已知的和新的PMIs。
图1. KSEC-MS的概念描述。从人血清(M)和蛋白质(P)中提取的代谢物以间隔时间T1顺序地进样到SEC柱中。由于不同分子在SEC柱中的迁移速率不同，不同分子的迁移模式随时间而变化(图A)。图B和C显示了当代谢物是蛋白质的配体时，P、M和蛋白质-代谢物复合物(P-M)的迁移模式和质量相对强度。图D和E显示了当代谢物不是蛋白质配体时P、M的迁移模式和质量相对强度。
1、KSEC-MS方法的验证
为了验证该方法，作者选择碳酸酐酶(CA)作为测试蛋白来验证KSEC-MS方法的可行性。CA可以催化二氧化碳与碳酸酐的可逆水合反应，将已知的CA抑制剂ACE加入到人血清中提取的代谢物中，利用KSEC-MS方法检验是否可以从复杂系统中确定已知的CA与ACE的相互作用。需要注意的是，当代谢物混合物的浓度固定时，目标蛋白浓度的增加可以促进蛋白质-配体复合物的形成。因此，在不同浓度的CA下进行了多次KSEC实验。KSEC的总离子流色谱图并未随CA浓度的增加而发生明显变化，表明代谢物与CA之间不存在严重的非特异性相互作用。经数据处理后，以质谱负离子模式从原始数据中提取了384个代谢物特征。当CA迁移模式的变化程度与CA浓度呈正相关，且两种不同的KSEC-MS实验(添加0μM CA/添加2 5 0μM CA)的峰面积下降率大于3时，确定了CA的潜在配体。根据上面的过滤规则，m/z为220.9785的化合物是从负离子模式的络合体系中定义出来的。随着CA浓度的增加，该化合物的色谱峰呈加宽和前移的趋势(图2A)，而在18.82min左右的峰面积逐渐减小。结果表明，该化合物在分离过程中可能与CA发生特异性的相互作用。随着分离过程的继续，CA-配体复合物开始解离，色谱峰出现前移趋势。此外，其迁移方式的变化程度与CA的浓度呈正相关。根据其准确的质量和MS/MS谱，初步推测m/z220.9785的化合物为血管紧张素转换酶ACE。因此，由KSEC-MS方法定义的CA的潜在配体(m/z 220.9785)被确定为血管紧张素转换酶。其他代谢物的离子色谱图不受CA蛋白的影响，因此，没有来自代谢物混合物的其他代谢物被定义为CA的潜在配体。这一验证实验表明，基于KSEC-MS方法，蛋白质和代谢物之间的相互作用可以从一个复杂的系统中定义为具有很强的特异性。
图2. (A)化合物m/z 220.9785的萃取离子色谱图随CA浓度的增加而变化；(B)MS/MS谱与化合物m/z 220.9785和乙酰唑胺标准品的结果相吻合。
2、基于KSEC-MS定义HSA的PMIs
为了进一步证明KSEC-MS方法在确定PMIs方面的有效性，选择HSA作为目标蛋白，从人血清中提取的代谢物中寻找其配体。人血清白蛋白(HSA)是血浆中含量最丰富的蛋白质，通常作为脂肪酸、胆色素、氨基酸、类固醇激素、金属离子等的转运载体。根据KSEC-MS方法的原理，只有当目标蛋白在SEC柱分离过程中与配体相遇时，才能确定配体。因此，代谢物塞子和蛋白质塞子之间的时间间隔应尽可能短。在本实验中，时间间隔设定为0.25分钟，这也是所用仪器两次注射之间的最短时间。在5种不同浓度的人血清白蛋白(HSA)下进行多次KSEC实验。如图3所示，KSEC的总离子流色谱图不随HSA浓度的增加而发生明显变化，证明蛋白质与代谢物之间不存在物理吸附引起的非特异性相互作用。值得注意的是，由于HSA的基质效应，在5min左右出现了一个对应于HSA洗脱的负峰。它的衰减程度与HSA的浓度成正比。
图3. 正离子模式下不同人血清白蛋白浓度下KSEC-MS的总离子流色谱图。
经过数据处理，在正负离子模式下，从原始数据中提取了2205和929个代谢物特征。当HSA迁移模式的变化程度与HSA浓度呈正相关(Ratio 1<Ratio 2<Ratio3<Ratio 4<Ratio 5)，且Ratio 5大于3倍时，确定了HSA的潜在配体。最后，在负离子和正离子模式下定义了39个潜在的HSA配体(表1和表2)。
表1. KSEC-HRMS定位HSA配体(负离子模式)。
表2. KSEC-HRMS定位HSA配体(正离子模式)。
在负离子模式定义的27种潜在的HSA配体中，大部分是人体血浆中常见的内源性代谢物，如硫酸睾酮、硫酸雄酮、十六烷二酸、十二烷二酸、胆酸、3-羧基-4-甲基-5-丙基-2-呋喃丙酸(CMPF)等。作为一个典型的例子，十二烷二酸的EICS如图4A所示。十二烷二酸的色谱峰呈加宽和前移的趋势，其原始保留时间(7.68min左右)的峰面积逐渐减小。在图4B中，以十二烷二酸为标准进行了KSEC-MS实验，证实了人血清白蛋白(HSA)与十二烷二酸的特异性相互作用。化合物(m/z 229.144)和十二烷二酸的MS/MS匹配结果证明了非靶向代谢组学的定性可靠性。此外，还采用KSEC-MS方法对全氟辛酸(PFOA)和全氟壬酸(PFNA)进行了定义和鉴定。这二者作为常见的环境污染物，通常通过食物、空气和水进入人体。全氟辛酸的色谱峰与十二烷二酸的色谱峰呈现相似的变化趋势。PFOA标准的KSEC实验表明HSA和PFOA之间存在特定的相互作用。化合物(m/z 412.9660)和全氟辛酸的质谱匹配结果证实了该鉴定。PFOA作为人血清白蛋白(HSA)的外源性配体，可能对内分泌、免疫和神经系统产生严重影响。
图4. 十二烷二酸的萃取离子色谱图随人血清白蛋白浓度的增加而变化。(A)无针对性的筛查；(B) 标准十二烷二酸。
根据以前报道的方法，在HSA和PFOA标准之间进行了“一对一”的KSEC-MS实验，以推导相互作用的动力学过程。用COMSOL多物理软件模拟了HSA与PFOA的相互作用，计算了相关的动力学参数。计算出HSA与PFOA的解离常数为2.77×10-3molL-1，表明HSA与PFOA具有中等的结合亲和力。
出乎意料的是，一些迁移速度快于人血清白蛋白的非极性配体也可以用KSEC-MS方法定义。随着HSA浓度的增加，油酸的色谱峰在5min左右逐渐增加。这是因为在实际的柱内迁移过程中，油酸的色谱带分布较宽，一小部分迁移速率较慢的油酸在相遇时也会与HSA相互作用，形成HSA-油酸复合物。这种HSA-油酸复合物在5min左右从SEC柱上洗脱下来，在质谱电离过程中解离成游离的HSA和油酸，后者可在5min左右被MS检测到。亚油酸和花生四烯酸表现出与油酸相似的现象，它们都被报道为人血清白蛋白(HSA)的非极性配体。表2给出了12种定义为在正离子模式下检测到的HSA的潜在配体的化合物。其中3,4,5-三甲氧基肉桂酸也在负离子模式下被定义，证明了该方法的可靠性。除已知的配体外，还从复杂的血清提取物中定义和鉴定了许多新的潜在的HSA配体，如4-乙烯基酚硫酸盐、4-苯基丁酸-O-硫酸盐、3-氧代十四酸、磺基甘油胆酸等。它们大多是内源性代谢物，其转运过程可能受人血清白蛋白(HSA)的调节。这些配体的确认还需要进一步的研究。从表1和表2可以看出，KSEC-MS方法确定的潜在配体的分子量较低，其油/水分配系数(LogP)在0~5之间。它们大多是极性代谢物，而不是人血清中浓度较高的非极性脂质。用以往的方法在人血清中很少发现极性代谢物作为人血清白蛋白(HSA)的配体。这是由于在KSEC-MS方法中，水溶剂作为流动相，极性代谢物比非极性脂类具有更好的分离和溶解性。因此，这种无标记的方法更适合于确定蛋白质和极性代谢物之间的PMI。在这项研究中，建立了一种无标记的在线KSEC-MS方法，结合非靶向代谢组学来确定PMIs。真实生物样本中目标蛋白的内源性配体可以通过“一对多”(即一个蛋白vs多个代谢物)研究范式来定义。作为一个验证实例，从复杂的血清提取物中成功地确定了乙酰唑胺(ACE)作为碳酸酐酶(CA)的已知抑制剂。除了一些已知的配体外，从人血清中提取的代谢物中的许多极性代谢物被同时定义和鉴定为新的HSA配体。因此，所建立的方法可以用来定义和识别复杂系统中的多个PMI。在这项研究中，作者提出了一种基于无标记KSEC-MS和非靶向代谢组学的从复杂系统中定义和识别未知PMI的方法，特别是极性代谢物与蛋白质的相互作用。因此揭示生理条件下的PMIs功能可以揭示疾病/健康状态的分子基础，对人类健康和医学发展具有重要意义。
原文网址：https://doi.org/10.1021/acs.analchem.0c00495
