编译：东方不赢，编辑：Emma、江舜尧。
原创微文，欢迎转发转载。
导读
蛋白质翻译后修饰（PTM）可以协调细胞发育，信号传导和基因调节。赖氨酸（Lys / K / K-Me）和精氨酸（Arg / R / R-Me）的甲基化（Me）是真核蛋白的常见蛋白质翻译后修饰形式，由真核生物进化出的甲基转移酶类催化，这是表观遗传学的重要研究内容之一。目前的技术手段已鉴定出高等真核生物中丰富的甲基化底物以及甲基化在新陈代谢，翻译和RNA结合蛋白中的调控。这些发现推动了甲基转移酶类蛋白质及其染色质外特异的性鉴定，并有助于推进真核生物细胞研究的进程与相关性人类神经系统疾病和癌症的研究的发展。
真核生物甲基蛋白质组在哺乳动物和酵母中最容易被鉴定，有着甲基化底物的进化范围上的巨大拓展，且甲基转移酶具有多位点，多催化状态的调节特征。酿酒酵母（萌芽酵母）为代表的进化完整的真核生物具有更简单保守的甲基蛋白质组的甲基化模型。但酵母已经具有含扩展结构和新调控因子的旁系同源甲基转移酶，并脱离了由真核生物特异性甲基化（R-Me，K-Me）进化而来的网络。这种复杂性给鉴定非组蛋白和非核蛋白甲基化，揭示甲基化功能，了解非甲基化蛋白质相互作用，及了解PTM的共调节作用（例如磷酸化）带来了障碍。确定一个简单的真核生物模型将有助于阐明这种复杂性并对甲基化保守功能进行深入研究。
原生生物是真核生物中最原始的类群，是解构这种复杂性的理想物种。许多原生生物简化了源自真核生物早期进化特征，寄生原生生物基因组在生态适应过程中有二次损失。肠梨形鞭毛虫（双滴虫目）属于最古老的分支门之一——后滴门，是一种是哺乳动物小肠的寄生虫。在人类中，肠梨形鞭毛虫感染每年导致约2亿例腹泻病，分别通过毒性活动体和环境适应性囊肿感染传播。
后滴门生物具有许多减少或消失的真核生物保守基因，其中包括蛋白质甲基转移酶。甲基转移酶类酶有五种（I-V），而靶向蛋白质的通常是I类和V类。早期研究表明肠梨形鞭毛虫甲基转移酶的不存在精氨酸甲基转移酶类（PRMT），及其分化的V类赖氨酸甲基转移酶。这些发现突出表明肠梨形鞭毛虫中的甲基蛋白质组与其进化而来祖先相符，但其甲基化蛋白质组有参与调节寄生虫的发育，抗菌素耐药性和毒性的特殊性质。贾第虫甲基转移酶基本功能尚未探明，未来可以作为研究寄生虫抵御的新研究目标。
肠梨形鞭毛虫是一种早于酵母和脊椎动物进化出的原生生物，对其宿主胃肠生态具有独特适应性。与其他模型生物进行对比，贾第虫具有研究甲基化蛋白质组的优势明显。这项研究中，研究者鉴定了肠梨形鞭毛虫的甲基蛋白质组并探索其在后滴门中的演变，创新性确定了精氨酸甲基转移酶的缺乏和这种酶优先结合的基序。多种蛋白质组学方法都未检测到甲基精氨酸，于是贾第虫属成为真核生物中首个发现不存在精氨酸甲基化网络的物种。使用质谱和创新性的甲基位点过滤试验方法，研究者确定了鞭毛虫的200个高度可信的赖氨酸甲基化位点，该结果提供了eEF1a赖氨酸甲基化进化保守性的实验证据，展现了其丰富的细胞骨架卷曲螺旋特征以及甲基赖氨酸物种特异适应性。最后，研究者使用甲基化抑制剂破坏了体外寄生虫传播模型和毒性，证明了氨酸甲基转移酶的细胞骨架调节和侵入作用。该研究进行了全面的功能探索和进化学探究，提供了特异性抑制寄生虫的潜在途径以及研究真核生物中蛋白质甲基化进化新思路。
原名：Eukaryote-conserved methylarginine is absent in diplomonads andfunctionally compensated in Giardia译名：肠梨形鞭毛虫属（双滴虫目）缺失在真核生物中保守的精氨酸甲基化的补偿机制期刊：Molecular biology and Evolution通讯作者：Samantha J.Emery-Corbin通讯作者单位：澳大利亚，墨尔本，澳大利亚斯帕克维尔的研究所
1. 甲基转移酶的生物信息学分析
研究者使用基于隐马尔可夫模型（HMM）的算法HMMER来进行计算。采用文献提供模型生物中蛋白质甲基转移酶的氨基酸序列，蛋白质亚家族信息和UniPro数据库中下载的蛋白质序列，用MUSCLE对每个甲基转移酶亚家族进行了多序列比对。使用MSA中的Hmmbuild算法为每个亚家族构建HMM结构文件，使用CLUSTALW进行MSA比对，然后对完整的贾第虫WB基因组的蛋白质编码序列和多个其他物种相似蛋白基因进行比对。手动检查结果中筛出的功能域，使用功能域映射软件HMMER，SMART-EMBL和PROSITE来进行确认。通过I-TASSER进行蛋白结构预测，使用Aline软件来可视化MSA结构。
2. 第五类SET功能域的赖氨酸甲基转移酶分析
采用HMMer鉴定出SET结构域蛋白。通过计算机预测了第五类赖氨酸甲基转移酶的SET折叠结构。将两个预测结果中缺少SET域折叠的结构全序列删除后提交给ITASSER分析。比较了从GiardiaDB.org和UniProt下载的蛋白功能域结构，通过InterProScan进行分别分析。MS文件通过修剪后的SET结构域的序列进行构建，并与经过检验的人类HKMT的SET结构域进行比较，以获得保守的辅因子结合残基，催化残基和SET“假结”残基。研究者从多种真核生物（拟南芥，黑腹果蝇，人类，粉色面包霉菌，酿酒酵母）中得到一个代表性的SET功能域的蛋白质组，此结果与贾第虫进行比对，还另外与贾第虫亚种直系同源物沙门氏菌对比。包含SET结构域的蛋白质基于三个独立的域模型用InterProScan分析得到，使用Pfam或Prosite数据库进行注释，最后用SMART进一步注释。共有139个SET结构域蛋白使用程序MAFFT比对得到，用MUSCLE手动修正并进一步完善。使用MrBayes来构建进化树。
3. 第一类七个ß链（7BS）赖氨酸甲基转移酶分析
采用HMMer鉴定出新型7BS 赖氨酸甲基转移酶。从GiardiaDB.org下载贾第虫7BS赖氨酸甲基转移酶基本序列架构，经验证该结构含SAM依赖性甲基转移酶注释和（或）第16家族甲基转移酶，同时包含I类折叠，且通过PBD预测的结构与已知的I类赖氨酸甲基转移酶匹配。在鞭毛虫中鉴定出两个家族16可能的甲基转移酶通过MSA将与其最接近的PDB结构匹配项VCP-KMT进行了比较，此外在文献中METTL21D 直系同源物使用ClustalW进行验证。催化和辅助因子结合残基的鉴定在同一文章中也被鉴定。其他贾第虫亚种的直系同源物也进行了分析。与eEF1a-KMT4具有同源性的三种蛋白质，与人类Efm4家族eEF1A-K甲基转移酶的直系同源基因通过MSA进行比对，确定了基序，可能的催化和辅因子结合残基。
4. 蛋白质精氨酸甲基转移酶（PRMT）分析
采用HMMer进行PRMT分析。通过HMM分析得到两种其他寄生虫含有PRMT功能域的蛋白质结果，使用I-TASSER进行HMM结构模拟。另从文献得到源自阴道毛滴虫的PRMT进行同源性分析。
5. 双滴虫目，原生动物寄生虫和高等真核生物的RGG / RG基序分析
从文献中获得Tri-RGG，Di-RGG，Tri-RG和Di-RG的普遍表达模式，并使用orthoMCL 通过“蛋白质基序”搜索功能进行14个基因组搜索。获得每个数据的OrthoMCL组标识，基序数量和位置，以及PFAM功能域和域注释，Gar1蛋白和原纤维蛋白同源蛋白组进行RGG / RG的基序排序分析。前文提到的三种寄生虫直系同源物也包含在内。用PrDOS预测Gar1蛋白和原纤维蛋白结构变化矩阵。
6. 组氨酸变体中的保守赖氨酸和精氨酸位点分析
来自16个物种，包括源自高级真核生物和模式生物，寄生生物，后滴门类和双滴虫目的组氨酸（Histone 3.1）变体的MSA进行分析。具有大于 0.75相似性的精氨酸和赖氨酸残基被认为是保守的。
7. SND1同源性分析
使用CLUSTALW比对得到16种物种的葡萄球菌含SND1的结构域核酸酶直系同源蛋白，其芳香族残基表明Tudor结构与甲基精氨酸结合有关。使用OrthoMCL获得蛋白质域结构并在UniProt数据库进行验证。
8. 活动体体外培养和成囊
将贾第虫的培养物置于装有含有葡萄糖，灭活牛血清和牛胆汁的培养基在平板试管内培养。为了提升蛋白质产量，将培养物密封在玻璃瓶中固定并直立培养。将融合培养物在冰上冷却并继代进入成囊前状态，用低胆汁培养基24小时培养至次融合状态，在24小时后，将培养基倒出，留下粘附的活动体。为了获得纯净的I型囊肿，将48小时后的沉淀物质在无菌水中于4°C孵育过夜以裂解未融合的活动体。此过程重复两次，共72小时。
9. 甲基赖氨酸和甲基精氨酸的氨基酸分析（AAA）
简而言之，通过气相酸水解进行贾第虫总蛋白和HeLa蛋白水解。水解的样品，BSA对照品和氨基酸标准品和AQC试剂用来进行柱前衍生化。在ACQUITY UPLC系统上进行氨基酸分离和定量。
10. 免疫亲和纯化（IAP）与质谱分析（LC-MS/MS）
使用PTMScan泛甲基赖氨酸来进行免疫亲和纯化。将活动体溶于尿素中HEPES中进行温和超声处理。在37°C下用DTT还原30分钟，然后用碘乙酰胺处理15分钟。通过BCA分析验证了蛋白质浓度，将10mg的蛋白质在37°C下用内切蛋白酶Lys-C预消化3小时，将蛋白质水解后以胰蛋白酶消化过夜。通过用三氟乙酸（TFA）酸化至1％终止消化。使用色谱柱进行多肽纯化，最后冻干干燥。采用两种IAP磁珠富集甲基赖氨酸和甲基精氨酸修饰的多肽。小鼠肝肽用作IAP的阳性对照，与贾第虫pulldown平行进行。富集后，样品使用内部C18吸头进行脱盐，在真空离心机中干燥后用胰蛋白酶消化。样品被酸化，用C18吸头脱盐，真空离心至干后溶解在0.1％TFA和2％ACN来进行质谱分析（LC-MS/MS）。IAP纯化后的组分在Orbitrap Fusion Lumos上进行质谱。总共有10个甲基赖氨酸修饰的蛋白质馏分（K-Me）生物学重复，4个R-MMe重复。小鼠肝肽对照中共有2个K-Me和2个R-MMe的IAP馏分，相同条件下进行梯度洗脱。
11. 数据库挖掘及甲基赖氨酸（K-Me）位点定位和过滤
K-Me和R-MMe IAP馏分的所有原始数据分析均采用Maxquant软件，首先用序列来自贾第虫WB基因组含有常见污染物的序列以及UniProt数据库中的人类序列，以排除培养基和血清的K-Me污染物。对照组小鼠IAP馏分的原始数据在UniProt鼠类序列数据库进行比对。使用iceLOGO Web服务器进行序列标记与基序分析分。使用DAVID进行GO分析，蛋白功能域标注，KEGG分析。使用STRING进行可视化蛋白质间相互作用以及重要的功能富集分析。使用UniProt注释预测的卷曲螺旋和锚蛋白重复区域，使用COILS进行七肽的映射分析。
12. eEF1A的N端甲基化的平行反应监测分析
通过SDS-PAGE分离对数中期贾第虫活动体的全蛋白裂解物，切下对应的凝胶条带并用N末端天冬氨酸消化。贾第虫eEF1AN末端天冬氨酸肽通过液相色谱平行反应分析监控（LC-PRM），其他分析在Orbitrap质谱仪上进行，实验中采用三种质核比对应检测三甲基化肽双/三/四电离的状态，非甲基化与三甲基化的跃迁离子色谱图使用Thermo Xcalibur中的Qual Browse获得。
13. 甲基化抑制剂处理贾第虫活动体的体外活力测定
利用购买的表观遗传抑制剂文库，在ATP诱导发光的384微量孔中筛选了复制中的10μM的活动体。单浓度筛选分为两份，一份放入具有杀伤作用的化合物，一份放入可复制的部分活性抑制物，通过2倍梯度10个位点进行稀释来估算反应浓度，计算IC50。所有化合物在DMSO中稀释，阴性对照中含有同等浓度的DMSO，阳性对照中含甲硝唑和阿苯达唑来“杀灭”对照化合物。在ATP诱导发光的94中通量孔较高浓度筛选了几种甲基化抑制剂。所有溶液均溶解在DMSO中。在最高100μM的浓度下对于KMT和PRMT抑制剂的活动体敏感性进行了评估，而对于组蛋白赖氨酸脱甲基酶抑制剂的测试浓度高达1000μM。实验进行三次重复。
14. 对数期活动体的体外KMT药物处理
在暴露前接种对数期活动体以达到中等融合状态，在24小时内达到对数期。活动体的亚致死性的计算值为1/2 IC50，对照管接种0.001％DMSO。通过对培养基柱二次采样和培养管过冰来分离计数附着的活动体，对活动体总数（附着的和非附着）进行计数。活动体生长和粘附性的基线是通过在0小时三次计数确定。活动体的生存力是通过台盼蓝拒染法进行。在两个时间点（8小时和24小时），将亚致死性药物处理对数期活动体并与DMSO对照进行比对以定量蛋白质组学和生长计数。收集活动体用于定量蛋白质组学分析。多种亚致死浓度15小时处理对数期活动体，然后通过离心分离蛋白质进行K-Me免疫印迹。定量蛋白质组学和免疫印迹使用总粘附/非粘附的活动体。
15. 体外KMT药物诱导成囊培养
通过将KMT抑制剂（或仅DMSO媒介物）加入低浓度胆汁后再浸入培养基。两个时间点（8小时和24小时）亚致死性药物处理活动体来进行定量蛋白质组学，三次重复，阴性对照DMSO阴性。多种活动体亚致死浓度8小时处理成囊培养物，并提取蛋白质进行免疫印迹。为观察KMT抑制剂在囊肿形成过程的作用，培养物在高胆汁培养基中浸渗48小时，然后I型囊肿通过低渗裂解富集并在沉淀后计数。该材料也被用于三联体提取蛋白以进行免疫印迹。
16. 甲基赖氨酸修饰蛋白的免疫印迹
将HeLa细胞蛋白裂解物为必要的阳性对照。采用一致的蛋白质加载量进行BCA分析，通过Ponceau S染色转移后进行验证。通过BioRad ChemiDoc MP成像系统检测辣根过氧化物酶（HRP）是否结合免疫球蛋白G。对每种抗体的曝光时间进行了优化，最多收集了基于分辨率和没有过饱和最多180秒的图像。
17. KMT抑制剂处理的活动体的扫描电镜分析
将对数期滋养体暴露于多种亚致死浓度固定5个小时，与DMSO对照进行形态学分析。将活动体暴露于亚致死性浓度的KMT抑制剂处理成囊期活动体8小时和24小时后，用含2.5％戊二醛的PBS固定。之后样品在PBS中洗涤，固定在圆形盖玻片上， 通过乙醇梯度脱水后烘干。使用粘性碳将盖玻片粘贴于模具上，使用镀金封片。使用电子探测器对活动体进行SEM成相。
18. KMT抑制剂处理的贾第虫的定量蛋白质组学
在Tris SDS缓冲液进行蛋白质提取。蛋白质在37°C下还原，通过甲醇/氯仿沉淀，转移到含8M尿素Tris缓冲液中浓缩，通过BCA测定法定量。然后在37°C的胰蛋白酶消化过夜消化。样品用TFA酸化，脱盐，干燥后，复溶于TFA用于LC-MS / MS。LCMS / MS在LTQ Orbitrap Elite上进行梯度洗脱。
19. KMT抑制剂处理的贾第虫的数据库搜索和生物信息学分析
使用Maxquant软件进行数据库搜索和无标签定量。对数期活动体和成囊阶段活动体原始数据的分别搜索。对肽链强度求和并去除反向肽诱饵和污染物。由于检测到的肽存在较大差异，因此在EC和TYI培养基中进行的实验数据为分别处理如下。对18个样品中至少8个检测到的特异肽进行了对数转换并使用limma软件进行归一化分析。化学处理之间差异表达的肽使用具有经验贝叶斯t统计的线性模型进行计算。用GSAE进行多肽差别富集表达分析。
20. 电脑自动对接肠梨形鞭毛虫SET域的蛋白质与KMT抑制剂
采用AutoDockTools（ADT）软件对接预测的蛋白质结构内的小分子。用完整贾第虫SET结构域中模拟了BIX-01294对接结构，并与BIX-01294和SAM结构进行对比。此外，将智人G9a蛋白和贾第虫GL_9130与脂蛋白对接，GL_9130与SAM对接。贾第虫SET结构域蛋白的3D结构与G9a的SET结构域比对以定位活性位点，然后使用BIX-01294，SAM和脂蛋白分子以及预测的活性位点进行对接研究。使用ADT-vina版本2与ADT来分析和绘制蛋白质残基和抑制剂分子之间的相互作用。
1. 甲基转移酶的电脑处理结果
研究者使用自定义的隐马尔科夫链方法（HMM）对五个后滴门物种中的类别I（7ßS，PRMT）和类别V（SET域）蛋白质信息进行了生物信息学分析。使用3D预测建模的结构检验包含甲基转移酶结构域的蛋白质结构。研究者鉴定出13种蛋白质的甲基转移酶，其中11个是推测的的K-甲基转移酶（6个五类， 5个一类），其余的是N端蛋白甲基转移酶1（NTM1; GL_12215）和亮氨酸羧基甲基转移酶（PPM1; GL_10516）。未找到贾第虫蛋白PRMT域位置。
2. 歧化的第五类赖氨酸甲基转移酶
第五类赖氨酸甲基转移酶SET域的包含“假结”结构，具有单独的底物和SAM促进赖氨酸的甲基化结合裂隙。研究者使用自定义HMM功能确认了之前报道过的六个的V类赖氨酸甲基转移酶，没有其他可能的酶（图1A）。所有六个贾第虫蛋白均含有保守的“假结”残基。系统发育分析揭示只有贾第虫两个酶与高级真核生物SET域家族可以聚类，而其余的则形成了贾第虫特有的分支，表明存在分歧进化差异（图1B）。总体而言，贾第虫SET结构域蛋白具有域结构的减少（图1A），可能会影响蛋白质间相互作用并促进更广泛的底物特异性。例如，尽管其中一个和人类同源酶的SET域有很强烈直系同源关系，但人类直系酶中大于 2000的AA残基还有多个编码结构域（图1B）。贾第虫蛋白质组的结构建模预测了全序列其中四个酶（GL_9130, GL_221691, GL_17036 ， GL_13838）具有第五类假结折叠的结构。研究者还建模预测另外两个酶（GL_8921，GL_6407）有仅限SET域结构的第五类折叠。在预测的结构中，SET结构域蛋白（GL_9130，GL_221961，GL_8291，GL_13838）与SET和Myeloid-Nervy-DEAF1（MYND）域蛋白不同（SMYD；GL_17036，GL_6407）。GL_17036和GL_6407中的详细域搜索确定了SMYD域特质（PTHR12197），并非MYND锌指蛋白结构，属于文献中提及 SMYD蛋白常见特征。有趣的是，GL_221691有一个预测结构可以同时与SET域和RING-ASSOCIATED（SRA）域匹配，说明可以发生蛋白质（SET）和核酸（SRA）双重甲基化。贾第虫SET结构域的序列分析进一步支持了SET和SMYD分类，在GL_9130（F）和GL_13838（Y）中存在F/Y的转变。这些F/Y残基赋予甲基赖氨酸产物特异性（单，双，三）。在其他贾第虫赖氨酸甲基转移酶中缺少此残基转化并减少域结构可能会降低其底物特异性。
图1 肠梨形鞭毛虫第五类含SET域的甲基转移酶
3. 新型的第一类甲基转移酶（I K-MTase）和保守的eEF1a甲基化
第一类甲基转移酶具有七链β-折叠（7BS），并且可以使核酸，蛋白质或代谢物甲基化。研究者通过HMM确定了贾第虫中属于真核生物第一类赖氨酸甲基转移酶的5种新颖的酶，其预测的蛋白质结构中的7BS折叠匹配的一类赖氨酸转移酶，特别是与eEF1a-K甲基转移酶的PDB结构匹配（图2）。在其他后滴门物种中发现了相似的序列直系同源物），并说明这些eEF1a赖氨酸甲基转移酶家族在真核生物中的进化分支较早出现。两种贾第虫第一类甲基转移酶（GL_100959，DHA_151673）与16族（MTF16）METTL21赖氨酸甲基转移酶同源。序列和预测的结构与人类METTL21D具有同源性（图2A）。人类METTL21D使含有缬沙星的蛋白质（VCP）的K315甲基化，但该赖氨酸残基在贾第虫的VCP同源物中不保守。但是，MTF16赖氨酸甲基转移酶也可以靶向eEF1a，贾第虫 DHA_151673与酿酒酵母中的Efm7具有37％的序列相似性，都有催化eEF1aN端甲基化功能。考虑到它们与eEF1A-K甲基转移酶的Efm4家族内的eEF1A-KMT4的序列和结构同源性，另外三个鉴定出的贾第虫基因（GL_3948，GL_4349，GL_5013）应该也具有使eEF1a甲基化的功能（图2B）。GL_4349和GL_5013的当前注释为“内皮素转化酶2”，与人ECE2蛋白中的eEF1A-KMT先前注释的功能相同。
图2 肠梨形鞭毛虫I类7-ß-折叠预测K-甲基转移酶
预测贾第虫的eEF1a蛋白质结构域类似于人的eEF1a蛋白（图3A），可编码类似于其他真核生物中甲基化的目标赖氨酸残基（图3B）。研究者基于结合LC-MS/MS的赖氨酸甲基化多肽的抗体富集检测了eEF1a的K55甲基化。K55位点在人体内可有Efm4家族的eEF1A-KNMT甲基化的。因此推测贾第虫Efm4类似甲基转移酶（图2B）可能会将eEF1a的K55甲基化。研究者还使用靶向质谱法检测了eEF1a的N端三甲基化。鉴于DHA_151673与酿酒酵母Efm7具有同源性，观察到DHA_151673可催化N端甲基化。考虑到酵母，人类和贾第虫之间都有N端甲基化，这种修饰在真核生物中可能是保守的。该推论实验数据有限定，研究者认为在真核生物中该甲基位点证据不足，标准方法不太可能鉴定出该位点。尽管K79-TMe被认为是真核生物保守修饰，在后滴门物种中缺未鉴定到类似甲基转移酶的直系同源物，而研究者在贾第虫中也未检测到K79甲基化。肠梨形鞭毛虫的生物信息学分析出第一类赖氨酸甲基转移酶和检测到的eEF1a赖氨酸甲基化位点共同展示了真核生物中蛋白质翻译调控的早期进化过程。
图3 Giardia eEF1a的结构与赖氨酸残基保守性
4. 双翅目中精氨酸甲基化网络的缺失
在人类中九种PRMT蛋白质族可催化精氨酸甲基化。I型PRMT（PRMT1-4、6、8）催化单精氨酸甲基化和不对称二甲基化（ADMA）。II型酶（PRMT5，9）催化单、对称二甲基化（SDMA），III型（PRMT7）催化单甲基化。在单细胞真核生物中PRMT1（I型）和PRMT5（II型）直系同源物是保守的，并且这种组合是催化所有R-MMe，ADMA和SDMA甲基化的基本保证。所有已发表的贾第虫属研究中均不存在PRMT。前者研究中包含后滴虫类仅包括贾第虫和滴虫。为了评估PRMT缺失是否贾第虫特异，研究者建立了新的HMM，包括所有九个I型和II类PRMT家族，并搜索了尚未探索其他后滴虫甲基转移酶基因组。研究者包含了四个文献中提及的后滴虫基因组，其中三种中鉴定出四个系中的三个的PRMT1和PRMT5直系同源物（图4A）。这些发现表明不存在PRMT这个特点为双滴虫特有的，与其进化趋异过程中基因组减少有关。与甘氨酸相邻的精氨酸RGG/RG基序是真核生物保守的PRMT1和PRMT5优选的甲基化位点，其中一些蛋白质组中出现了大于1000个位点。研究者假设，在缺少PRMT的物种中，RGG基序的保守性较低且数量减少（图4A）。研究者在14个真核生物基因组中搜索了确定的RGG/ RG基序，RGG基序仅在是双滴虫蛋白质组中缺乏的（图4B）。有趣的是，研究者观察到其中两种蛋白直系同源物的保守无序区域，其保守性与RGG/RG基序并无关联（图4C）。
图4 精氨酸甲基化生物信息学分析
5. 贾第虫具有可检测的甲基赖氨酸但没有甲基精氨酸
研究者通过氨基酸分析（AAA）分析了肠梨形鞭毛虫甲基精氨酸R-Me和甲基赖氨酸K-Me的体外浓度。研究者在HeLa裂解物中检测到所有三个甲基精氨酸峰，在肠梨形鞭毛虫中未发现峰。研究者使用更为灵敏的AAA分析记录（SIR）模式来适应贾第虫（图5A），在贾第虫裂解液中未检测到RMMe峰，HeLa裂解液的R-MMe浓度为0.86μmol/g。研究者在贾第虫和HeLa蛋白裂解物中均检测到K-MMe，在免疫印迹肠梨形鞭毛虫中仅检测到K-Me修饰的蛋白质，而在HeLa裂解物中检测到所有六个R-Me和KMe甲基形式（图5B）。随后，研究者通过免疫亲和纯化和质谱分析可活动体和囊肿裂解物的R-MMe和K-Me修饰（图5）。过滤了假阳性位点后，使用小鼠甲基位点评估过滤保留在基本过滤中的六个R-MMe位点，发现他们未在直系同源物中报告，判定为假位点。在贾第虫中通过阈值过滤，总共鉴定出38个R-MMe位点，其中两个位点保留了需要2个相邻位点片段离子的严格过滤。肠梨形鞭毛虫R-Me在约第十五个氨基酸的位点窗口缺少RGG，而经过过滤小鼠的67个R-MMe位点具有RGG上下游强烈富集。PRMT1和PRMT5含有优先甲基化高丰度的RGG位点，这与通过计算机推断的贾第虫PRMT和RGG缺乏有关（图4）。综上所述，这些发现表明贾第虫缺乏甲基精氨酸PTM网络。
图5 体外精氨酸甲基化（R-MMe）与赖氨酸甲基化（K-Me）分析
6. 贾第虫卷曲螺旋结构的甲基赖氨酸（K-Me）位点和细胞骨架蛋白分析
研究者使用基本阈值过滤从160种蛋白质中鉴定出202个K-Me位点。使用小鼠甲基位点对这些过滤进行了高置信度测试，观察到与贾第虫相似的蛋白质和趋势（图6A，6B）。有趣的是，只有58/160（37％）KMe和40/160（26％）蛋白质分别在人类和酿酒酵母中具有直系同源物。这表明大多数贾第虫K-Me蛋白具有物种特异性。肠梨形鞭毛虫K-Me位点在-4，+ 1，+ 3，+ 4位的富含酸性谷氨酸残基（图6A）。研究者专门通过酸性残渣提取天冬氨酸过滤了假阳性位点，并注意到随着过滤严格，Glu/E富集度增加。使用STRING进行可视化并用DAVID进行功能注释（图6C），包括蛋白质翻译中的功能，注释了核糖体蛋白质，翻译起始因子IF-2以及eEF1a。贾第虫中的RNA代谢和细胞周期K-Me蛋白通常在人和酵母中被修饰为R-Me。人类大量的R-Me底物为氨酰基tRNA合成酶/连接酶，贾第虫K-Me蛋白中也有大量这类酶。贾第虫精氨酸分解代谢途径中的2/3个酶中的K-Me位点提供了一个调节寄生虫毒性的可能。最后，研究者确认了K-Me在表观遗传调控中的作用，确认了解旋酶和H3K37-TMe的存在。卷曲螺旋和锚蛋白重复在K-Me蛋白中显着过量出现（图6B）。卷曲螺旋为一个或多个的七肽重复序列（表示为a-b-c-d-e-f-g），其中“ a”和“ d”是在疏水核心处的非极性残基，而“ e”和“ g”是形成静电相互作用极性残基。这些残基是贾第虫K-Me位点独特的序列基序。研究者使用COILS鉴定了贾第虫具有K-Me修饰的七肽序列（图6D），并证明七肽经常出现Glu/E和Leu/L残基，与其在贾第虫K-Me序列基序中的富集相吻合（图6A）。研究者还注意到发生了K-Me七肽在溶剂可及的“ c”和“ f”残基上，未参与驱动α-螺旋形成的疏水或静电相互作用中。尽管卷曲螺旋K-Me位点范围跨越多种蛋白质，但在贾第虫中许多功能都与细胞骨架有关。NimA相关激酶和21.1蛋白在贾第虫K-Me中富集，贾第虫基因家族具有大量卷曲螺旋和ANK重复特征（图6B）。贾第虫编码的NEK数量最多并且大多数是属特异性的。将约200个肠梨形鞭毛虫NEK与11个人类NEK进行比对，只有一个人的直系同源物，而73.2％的贾第虫NEK具有不完整的激酶催化三联体。研究者在8/9甲基化的NEK中观察到完整的三联体。在这些卷曲螺旋中，出现6/10个K-Me位点，在ANK重复没有。尽管卷曲螺旋在贾第虫NEK中不如ANK重复普遍。在人类中，许多NEK-蛋白质相互作用都涉及卷曲螺旋区域，其中底物结合可能促进卷曲螺旋/亮氨酸“开放”。具有催化活性的肠梨形鞭毛虫NEK中的K-Me可通过调节卷曲螺旋构象和蛋白质-蛋白质相互作用来调节磷酸化。NEK激酶，ANK重复和卷曲螺旋基因家族被认为可调节基于贾第虫的细胞骨架及其相关结构。多种K-Me蛋白位于细胞骨架中，尤其是腹盘（图6E）。其K-Me蛋白包括微管运动蛋白，七个可能的纺锤体蛋白和微管蛋白特异性分子伴侣。微管相关蛋白中的许多K-Me位点都在卷曲螺旋七肽内，支持K-Me调节作用在细胞骨架和细胞周期中可能是通过卷曲螺旋甲基化进行调节的。
图6 鞭毛菌K-me位点与蛋白分析
7. 使用化学抑制剂探测贾第虫的甲基化
在贾第虫中基因敲除极为困难，基因沉默具有可变功效，因此研究者筛选了一组甲基化抑制剂可破坏其甲基转移酶。研究者没有观察到任何已知能抑制PRMT酶或R-Me功能的化合物的抗其活性，贾第虫缺乏这些酶和残基（图4，图5）。然而，研究者观察到两种第五类KMT抑制剂BIX-01294和Chaetocin对活动体的复制的中等抑制作用。在成囊期间评估这两种抑制剂，因为活动体在体外被诱导并分化为囊肿，在体外分化过程中，以低于其IC50的浓度测试了这些抑制剂，计算了囊肿的数量。与对照组相比，两种抑制剂可以有效地抵抗寄生虫（图7A），这些抑制剂剂量比活动体IC50低约5-10倍。贾第虫SET结构域（图1）降低了抑制剂的结合亲和力，导致观察到的活动体IC50值更高。然而，对分化中的活动体的功效提高表明两种抑制剂对GL_9130的结合力均得到改善，GL_9130可调节成囊并与哺乳动物HKMT的SET结构域同源性最高（图1B）。
图7 KMT抑制剂的抑制作用分析
8. KMT抑制剂阻止了对数期活动体的生长并减少了囊肿的形成
研究者将对数期活动体暴露于研究的致死抑制剂浓度下，并在10小时和24小时分析了细胞活力和粘附性（图7B）。与DMSO对照在10小时时相比，活动体总数减少了38.0％和50.1％，而粘附的总数减少了51.8％和19.7％BIX-01294和Chaetocin处理过的培养物中的活动体中，活细胞数保持大于90％，表明细胞复制减少而非细胞死亡导致鞭毛虫数量减少。BIX-01294处理的培养物到24小时恢复了细胞数。Chaetocin处理的培养物在24小时细胞数仍少36.5％，这表明抑制生长不可逆。对数期活动体的生长不需要表观遗传修饰，并且研究者观察到在接受KMT抑制剂处理后，活动体中H3甲基化没有显着变化（图7C）。相反，KMT抑制剂破坏了活动体中的细胞骨架结构（图7D）。BIX-01294处理影响了活动体表面，并使腹盘上的腹侧凸缘“滚动”。相比之下，经Chaetocin处理的活动体表面严重破坏。相比之下，KMT抑制剂对贾第虫的侵袭效力增加，由于甲基在分化过程中可能与染色质结构修饰和组蛋白H3重组有关。研究者观察到，在活动体的早期（8小时）侵染活动体时，对任何一种KMT抑制剂进行了亚致死处理都会降低H3 K-MMe，H3K4-DMe和H3K9-TMe甲基化（图7C）。此外，在暴露于抑制剂期间产生的囊肿H3 K-MMe总数较少，这表明其他H3甲基化减少了。在整个分化过程中，需要进行重要的细胞骨架重塑，KMT抑制剂在侵入过程中也破坏了活动体的重组（图7E）。观察表明，KMT抑制剂可能会影响含有多个K-Me靶位点的细胞骨架蛋白的甲基化（图5），以及在侵入过程中的表观遗传调控。
9. KMT抑制剂在生长和分化过程中的定量蛋白质组学
研究者探索了KMT抑制剂亚致死暴露期间的差异蛋白表达（图8A）。对数期和侵入期间与DMSO处理的对照进行比较，在对数生长期中稳定的地检测到了大量多肽，细胞培养基显着影响了特异性肽检测，因此需要对药物作用进行单独的定量分析（图8A）。同一细胞期抑制剂之间的肽倍数变化呈正相关（图8B），而同一抑制剂在生长和分化之间呈负相关，这表明抑制剂甲基转移酶的作用靶向目标是由细胞周期所决定的。
图8 KMT抑制剂处理对数期域成囊分化期蛋白质组分析
总体而言，抑制剂之间共有35个（9.5％）差异表达蛋白（DEP）对数期的治疗（图8C）。研究者观察到了几个一致的DEP之间的功能趋势（图8D），与微管蛋白驱动性有关。与BIX-01294相比，对数期的Chaetocin处理导致严重的细胞骨骼畸形和不可逆的生长停滞（图7B，7D），可能解释了观察到的一部分DEP（图8A）。基因组变化可上调Chaetocin处理的DEP涉及蛋白质折叠和蛋白质运输。ClpB的上调蛋白质可在压力条件下促进蛋白质折叠和蛋白质分解在Chaetocin处理期间在13个下调的蛋白质在核糖体中起作用， 14个DEP定位于细胞骨架结构。观察到的这些蛋白质调节与BIX-012940处理导致腹侧翼缘变化以及Chaetocin处理期间细胞骨架变形（图7D）有关。葡萄糖-6-磷酸N-乙酰基转移酶和ENC下调表明抑制剂可破坏K-MTase和导致甲基化失调。RNA和DNA解旋酶暴露于一种或两种抑制剂会上调，说明抑制剂可能会干扰基因的调控。多种贾第鞭毛虫特异性高半胱氨酸膜蛋白（HCMPs）上调具有chaetocin特异性（补充表11），表明甲基化调节复杂的潜在功能，这些数据表明活动体甲基化的独特作用。
10. 第五类赖氨酸甲基转移酶与KMT抑制剂的计算机对接
BIX-01294和Chaetocin通过结合到活性位点抑制催化的SET结构域（组蛋白底物竞争性）或SAM结合位点（辅酶竞争性）。研究者对第五类赖氨酸甲基转移酶药物结合位点，GL_9130之间的分子相互作用进行了详细的建模，包括SAM和两种药物配体（图9）。首先，通过分子之间的相互作用进行比较来验证我们的计算机分子模型确定了BIX-01294与G9a / GLP的结合，然后计算了结合亲和力，并正确预测了由晶体结构，在BIX-01294与四个预测结构之间进行了计算机对接具有完整蛋白质结构的第五类K-MTase，预测结合亲和力与其与SET结构域相对同源性一致（图1B），对GL_9130的亲和力最高。对GL_9130与SAM和两种药物配体之间的分子相互作用进行了详细的建模（图9）。GL_9130的最接近的序列结构匹配为NSD1，在BIX-01294结合的赖氨酸通道中，与G9a相比，存在结构上差异。因此，将GL_9130与公开的分子模型进行了活性位点比较和辅因子位点构象（图9B），与G9a分子模型（图9A）明显不同。这些预测结果之前研究结果相同，都验证了GL_9130通过靶向结合的高亲和力，来增加侵入过程中抑制剂的功效。贾第鞭毛虫的甲基化在生命周期阶段之间在功能上有所区别，其主要参与活动体的细胞骨架，细胞周期和代谢调控，并可参与细胞周期过程中染色质调节。其特别的蛋白质甲基化的减少颠覆了之前关于真核生物甲基化保守性的观点，在原生生物中保守的赖氨酸甲基化在酵母等生物中反而是不保守的，此问题的解决需要未来整合大量真核生物数据。本文介绍的方法通过简单的系统验证了原生生物作为早期真核细胞发育的模型，其特有的转录后修饰调控特点，为了解高等真核生物中复杂的蛋白质修饰机制，提供了一个独特的甲基化蛋白质研究模型。原文链接：https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/32702104/
