科研 | Cell：跨物种单细胞分析揭示灵长类小胶质细胞程序的差异
编译：杨峰，编辑：十九、江舜尧。
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小胶质细胞是脑内的免疫细胞，在脑的许多生理和病理过程中起着重要作用，包括神经退行性病变。在本文中，研究者描述了跨越超过4.5亿年进化的十个物种的小胶质细胞形态和转录程序。研究者发现小胶质细胞表达从啮齿动物到人类的同源基因的保守核心基因程序，包括与胶质细胞和神经元之间相互作用相关的配体和受体。在大多数物种中，小胶质细胞表现出单一的显性转录状态，而人类小胶质细胞则表现出明显的异质性。此外，研究者还观察到啮齿动物的一些基因模块与灵长类小胶质细胞相比存在显著差异，包括补体基因、吞噬基因和神经变性易感基因，如阿尔茨海默症和帕金森病。这项研究提供了关于保守和有差异的小胶质细胞途径跨越进化研究的重要资源，对人类小胶质细胞治疗的未来发展具有重要意义。
论文ID
原名：Cross-Species Single-Cell Analysis Reveals Divergence of the Primate Microglia Program
译名：跨物种单细胞分析揭示灵长类小胶质细胞程序的差异
期刊：Cell
IF：36.2
发表时间：2019年12月
通讯作者：Daniel Erny & Ido Amit & Marco Prinz
作者单位：德国弗赖堡大学以色列魏茨曼科学研究院
结果
实质小胶质细胞在进化过程中表现出一种保守的形态模式
为了确定整个进化过程中的小胶质细胞的保守性，研究者收集了18个进化距离较远物种的脑组织进行详细的显微镜分析（图1A）。研究者使用电离钙结合接合器分子1（Iba1）识别小胶质细胞，Iba1是人类、大鼠和小鼠的小胶质细胞、血管周围巨噬细胞和单核细胞的典型标记物，传统上用于识别实质内的小胶质细胞，因为它在其他胶质细胞和神经元中不表达。基于Iba1免疫组化的三维图像分析显示，18个物种中有16个的实质Iba+细胞呈阳性，而鸡和斑马鱼则不呈阳性。全骨髓的标记物mPEG1（mPEG1-GFP斑马鱼）和CSF1R（CSF1R-mApple鸡）随后被用于这些物种的实质内的骨髓性鉴定（图1B）。对Iba1+、mPEG1+和CSF1R+实质髓样细胞的显微镜分析显示，如前所述，细胞具有树突形态，包括梭形结构和明显的灌木状结构（图1B和S1A）。这些细胞的独特形态和广泛分布是与分支状小胶质细胞的经典描述高度一致。这些发现表明，在所有这些动物身上都可以发现具有小胶质细胞样形态特征和标记的CNS实质细胞，尽管研究者观察到物种之间拥有相当大的分支和细胞大小（图1B和S1A）。对小鼠和人小胶质细胞形态的分析显示，两种胶质细胞都存在部分区域特异性的异质性，包括较小的树突长度、较少的节段数、较少的支点和终末点在小脑的分子层（图S1B和S1C）。一般来说，人类小胶质细胞的整体形态与猕猴、小鼠、大鼠、仓鼠、绵羊、野猪、蝙蝠和鸡的小胶质细胞在树突长度、分支段数目、终末点和体积大小方面的相似性最高（图1B-1G和S1A）。水蛭神经节小胶质细胞密度最高，为299.0±41.4 Iba1+小胶质细胞/mm2，蝾螈中的小胶质细胞数最低（11.1±0.7/mm2）（图1H-1I）。
Fig1：进化的远距离动物小胶质细胞形态的定量分析
研究者对皮层神经元的数量和每个小胶质细胞的神经元数量进行了量化（图1J和1K）。在相关分析中，研究者检测到每平方毫米的小胶质细胞密度与跨物种的小胶质细胞突起长度呈正相关（图S1D），然而并没有观察到小胶质细胞密度与神经元密度（图S1E）或小胶质细胞/神经元比率与小胶质细胞突起长度之间的任何可检测的相关性（图S1F）。根据先前的报导，研究者检测到小鼠额叶皮质的小胶质细胞密度（65.8±1.09 cells/mm2）高于人类额叶皮质（35.5±2.48 cells/mm2），人类小脑（分子层）、海马和白质的小胶质细胞密度高于小鼠相应区域（图S1G-S1J）。总之，组织学分析表明，小胶质细胞的密度在不同物种之间有明显的差异，甚至在啮齿动物和大型哺乳动物之间也是如此。此外，虽然小胶质细胞显示出类似的树突形态，但在所观察的许多物种中，分支程度和细胞大小仍有很大的不同。
为了更好地理解小胶质细胞基因表达在进化过程中的差异性和保守性，研究者收集了8种具有高质量参考基因组的物种的3-6个个体的大脑：人类、猕猴、绒猴、绵羊、小鼠、仓鼠、鸡和斑马鱼。由于即使是经过仔细分类的Bulk RNA-seq技术样本中也可能含有污染细胞，而且scRNA测序技术可能对检测低表达的基因不够敏感，因此研究者使用单细胞和Bulk RNA-seq组合策略来描述整个进化过程中的小胶质细胞基因程序（图2A）。然后对单细胞数据进行分析，对BulkRNA-seq数据进行去卷积，去除污染基因。
Fig2：跨物种小胶质细胞的转录特征
为了保持小胶质细胞的原位转录状态，所有样本都是用高度保守的泛免疫标记物（蛋白酪氨酸磷酸酶，C型受体Ptprc/CD45）通过荧光活化细胞分类（FACS）进行新近处理和分类的。对细胞进行大规模并行的scRNA测序（MARS-seq2.0）分析或大量Bulk RNA测序（图2A）。我们共收集了8个物种的4458个质量控制（QC）阳性小胶质细胞，以及每个物种的3-6个Bulk RNA-seq样本（图S2B-S2D；表S1）。metacell算法被用来识别同质和富有活力的细胞组（查资料显示，根据先前报道：从单细胞转录组数据中鉴定出稳定且均质的细胞群称为“metacells”）。在被检测的物种中，大多数免疫细胞根据其基因特征被鉴定为小胶质细胞。然而，大多数物种含有一些被鉴定为污染细胞的metacell（表S1）。例如，在鸡中，对CD45+脑细胞的分析显示了两大类免疫群体（图2B）。第一组表达小胶质细胞基因特征，包括在人和小鼠小胶质细胞中已经识别的多个典型的小胶质细胞标记（如SALL1、P2RY12、C1QB），而第二组表达与T细胞相关的标记基因（如CD3E、RORA和IL7R）（图2B）。为了聚焦于小胶质细胞，在识别出污染的细胞簇后，研究者从Bulk RNA-seq数据中移除了与这些簇相关的基因（图2C、2D和S2E）。紧接着，研究者将这种小胶质细胞的单细胞特征和BulkRNA-seq去卷积数据分析方法应用于所有物种。总之，这些研究发现强调了在最小偏差的情况下，利用scRNA-seq技术去定义跨物种保守细胞类型转录特征的潜力，在整个进化过程中实现小胶质细胞程序的无标记分子比较。
为了比较跨物种的基因表达，研究者首先定义了一组跨物种的同源基因。紧接着使用了一种“元基因”策略来解决一对多和多对多的同源关系，这些关系通过复制/缺失事件在进化中发生了变化。同源猜想被广泛认为是一种在进化过程中配对基因的方法，因为直系同源的分化很慢，最明显的是以组织特异性的方式，而旁系同源则不是。在过滤掉低表达基因后，研究者鉴定出至少一个物种的小胶质细胞中表达的8890个基因。基因分位数归一化，然后对整个进化过程中小胶质细胞的去卷积Bulk和scRNA-seq进行聚类分析，确定了17个显著的基因簇。这些簇包括在所有物种（簇1-10）中表达的小胶质细胞核心特征，但在斑马鱼和鸡中表达的程度较低，以及进化枝和物种特定程序（簇11-17；图3A和S3A）。样本间的层次聚类根据物种的进化距离对其进行分组，显示出两个主要的类群，斑马鱼和鸡小胶质细胞构成哺乳动物的外类群（图3A和S3）。这不受聚类数或分析方法的影响，并且应用主成分分析（PCA；图S3B）时也观察到类似的结果。因此，研究者将斑马鱼和鸡从进一步的分析中移除，以关注哺乳动物小胶质细胞更微妙的变化。猕猴在表达模式上与人类小胶质细胞的相似性最高，而实验室小鼠与野生小鼠和仓鼠聚集在一起（图3A和S3A-S3E；表S3；STAR法）。
转录因子Spi1和Irf8是小胶质细胞发育的核心调控因子。Tgfbr2和Csf1r在小胶质细胞发育中也起着重要的信号作用，这些基因的缺失或其信号传导的抑制表明小胶质细胞明显减少或完全缺失。CSF1R突变也减少了人脑中的小胶质细胞数量。与这些结果一致，研究者观察到Spi1、Irf8、Csf1r和Tgfbr2在所有物种中的有高度的保守性和广泛表达，这支持了这些因子在小胶质细胞生物学中发挥核心作用的观点（图3A、3B和S3C）。溶酶体水解酶（如Cst3、Ctsa、Ctss、Ctsb、Ctsh、Ctsc、Ctsz和Hexa）在哺乳动物中均高度表达和保守。其中一些在巨噬细胞中广泛表达（如Ctsb，Ctsh和Ctsc），但也有一些在组织中的表达受限，它们的缺失（如Ctsa和Hexa）会导致严重的神经表型。另一个高度表达和保守的溶酶体基因Grn（或前乳蛋白）与人类和小鼠额颞叶痴呆有关。
小胶质细胞基因以前与小胶质细胞的稳态基因特征联系在一起，在所有物种中都是高度表达和保守的，包括C1qc、P2ry12和Tardbp（图3B、3C和S3C）。最近研究表明，Tardbp对AD小鼠模型的突触丢失具有保护作用，而它的缺失通过增强吞噬功能促进了淀粉样蛋白的清除。Vsir（或VISTA）是一种抑制T细胞反应的免疫检查点基因，在所有小胶质细胞中高度保守（图3C和S3C）。在一些神经系统疾病中，如AD，其表达增加。有趣的是，先前鉴定的卵黄囊衍生小胶质细胞的标记物（如Daglb、Bin1、Cst3、Sall1、Prpsap2、Entpd1、Tmem119、P2ry12和CD81；图3B、3C和S3C）出现在核心小胶质细胞簇1-3中。这些基因在小胶质细胞中高度富集，然而在小胶质细胞缺失的小鼠模型中植入大脑的单核细胞没有增加。
细胞蔟1-3中许多保守的小胶质细胞基因被其他组织巨噬细胞共享，这突出了小胶质细胞/巨噬细胞作为多细胞生物的吞噬细胞和防御细胞的感知作用（图S3F；表S4）。为了鉴定保守的小胶质细胞特异性基因，研究者接下来将跨物种核心特征（簇1-3）与之前发表的小鼠组织巨噬细胞大量的简编数据集进行了比较。这样做的目的是发现高保守和跨物种基因特异性的小胶质细胞，而不是其他组织巨噬细胞。研究者的跨物种分析鉴定出163个基因，它们对小胶质细胞既保守又独特（图3D；表S4）。其中包括Adgrg1（Gpr56），以前被证明在人、小鼠和斑马鱼中是保守的，这与少突胶质细胞的发育有关。另一个保守的小胶质细胞基因是Apbb1ip（图3D），它是APP、Tau、14-3-3γ和GSK3β的结合因子。研究者进一步确定了大脑的特定功能，例如投射神经元发育和小脑发育的调节，这是与这些小胶质细胞特定基因相关的最丰富的GO分析途径（图S3G）。这些结果表明小胶质细胞在所有哺乳动物物种中都表达一组保守的核心基因，包括与一般组织巨噬细胞功能和小胶质细胞特异性中枢神经系统适应有关的基因。此外，研究者还通过对一些动物的组织学研究确认其中的两个标记物，P2RY12和PU.1。
为了研究每个物种的小胶质细胞是否显示出均一的细胞类型或包含多个亚型，研究者进一步分析了小胶质细胞单细胞数据，以评估每个哺乳动物物种的小胶质细胞异质性。研究者首先分别对每个物种的小胶质细胞进行聚类，并比较聚类内和聚类间的相关性，以评估小胶质细胞亚型是否存在明显的分离或单个种群的连续体（图4A）。令人惊讶的是，与簇内相比，研究者在所有人类样本中观察到低的簇间相关性（图4A）。细胞间相关性分析显示，来自所有人类个体的小胶质细胞被分成多种小胶质细胞类型（图4B），这证实了先前的报道。这些亚型与性别差异无关，在雄性和雌性小胶质细胞中都能观察到（表S1；图4B）。人类小胶质细胞的异质性与小鼠、猕猴、狨猴、仓鼠和绵羊形成了鲜明的对比，它们表现出高度的簇内相关性，并且主要是一种显性小胶质细胞类型。在探索人类小胶质细胞的异质性时，研究者观察到一个亚群体，其与SASP相关的几个炎症基因表达增加，而稳态基因表达没有任何变化（图4D）。这种具有潜在衰老样小胶质细胞的炎症特征在人类和小鼠的所有年龄段的大多数组织中都已被发现，但其数量随着年龄的增长而增加。这些细胞与无菌炎症、伤口愈合和衰老相关过程（包括神经变性）有关。对这些假定的衰老样小胶质细胞的进一步研究表明，它们不是针对单个个体的，而是在所有6个样本个体中一致的，约占所有小胶质细胞的20%（图4B和4E）。该小胶质细胞亚群持续共表达CDKN1、CCL3、CCL4、CCL3和CCL4L2（图4F），同时高表达炎性细胞因子，如TNF和IL1B（图4B和4D）。在年轻的成年小鼠小胶质细胞中没有观察到这种特征（图4C），但在老年C57BL/6小鼠的小胶质细胞亚群中已经发现炎症细胞因子。
Fig4：单细胞RNA-Seq测序分析鉴定小胶质细胞异质性
人类小胶质细胞异质性的一个潜在来源可能涉及与非无菌环境的相互作用，然而，研究者没有观察到野生小鼠小胶质细胞的异质性（图S5E）。实验室小鼠模型在免疫系统调节方面显示出相当大的差异。然而，所有小鼠品系的小胶质细胞表达程序显示出高度的相似性（图S5F），只有少数基因被鉴定为小鼠品系间的差异（图S5G）。此外，比较四种实验室鼠系在SPF设施中的未受挑战的小胶质细胞和野生鼠在非SPF设施中的小胶质细胞，发现只有很少的差异（图S5H）。总之，单细胞转录组分析确定了人类中主要的异质性小胶质细胞，而其他哺乳动物在非病理状态下大多表现为稳态的单一小胶质细胞类型。
为了更好地了解与神经退行性疾病相关的基因的保守性，研究者扩展了单细胞分析的物种范围，增加了另外两种啮齿动物模型，大鼠和长寿盲鼹鼠（图5A、S6A和S6B）。人类小胶质细胞单细胞测序scRNA-seq转录组学数据与啮齿动物数据的成对比较确定了大量差异表达基因（图5A和S6C；表S5）。相比之下，研究者观察到人类和猕猴小胶质细胞之间差异表达基因的数量要少得多，其中大多数差异表达基因与代谢途径有关，如NADK和BCO2（图5A）。
与啮齿动物相比，对人类、猕猴、狨猴和绵羊特有的集群进行的路径分析揭示了DNA修复路径的丰富性（图S6D），这一点以前与长寿有关。此外，富集的途径包括吞噬作用，更具体地是凋亡细胞清除和补体途径（STAR方法；图S6G；表S6）。除小鼠外，其他几种途径在所有实验哺乳动物中均富集；特别是铁死亡途径的负调节（图S6H）。铁死亡是一种新的细胞死亡形式，它是由脂质修复酶谷胱甘肽过氧化物酶4（GPX4）活性和随后的脂质基活性氧（ROS）积累所驱动的，伴随着铁的胞质积累。有趣的是，其中一些细胞事件，包括吞噬功能缺陷，被认为是许多神经退行性疾病的标志性驱动因素，包括AD和PD。
啮齿动物模型对于人类理解许多生理和疾病机制至关重要。然而，从神经退行性变动物模型到人类临床试验的成功转换还需要很远的路要走。为了更好地了解与神经退行性疾病相关的小胶质细胞基因的保守性，研究者将人类小胶质细胞与常用的动物模型进行了比较。研究者比较了人和其他哺乳动物小胶质细胞GWASs中神经退行性疾病易感基因的表达（图5B），发现人小胶质细胞中PD和AD相关基因的表达与猕猴的相关性最高（PD，r=0.73；AD，r=0.59）（图5B）。相比之下，小鼠、大鼠和仓鼠与人类AD和PD易感基因呈中到低相关性（r=0.16-0.40）（图5B）。研究者发现PD基因的显著过度表达，在较小程度上，在人类特有的细胞簇和人类与猕猴共有的细胞簇中。相反，研究者没有发现任何动物的精神分裂症或亨廷顿氏病GWASs的基因有明显的富集或缺失。人类和猕猴的特异易感基因包括Msr1，Msr1介导低密度脂蛋白（LDLs）的内吞作用，参与淀粉样蛋白b（Ab）的摄取和降解。以前，小胶质细胞表达的基因与人类GWASs中的AD有关。然而，这是第一个确定AD和PD易感基因在小胶质细胞中的特异性富集及其在整个进化过程中的表达的研究。总之，研究者分析确定了参与代谢、补体和吞噬途径的多种小胶质细胞途径的表达的显著进化，其中许多途径涉及神经退行性疾病。
Fig5：稳态小胶质细胞物种间差异的比较
讨论
有效治疗神经退行性疾病的进程是受限的。这可能是由于中枢神经系统的复杂性，或者可能是由于缺乏相关动物模型的分子理解。本研究采用单细胞基因组技术和组织学分析相结合的方法，对10种不同进化距离的小胶质细胞进行了系统、全面的鉴定。本研究观察到哺乳动物小胶质细胞基因表达程序的保守性，这表明小胶质细胞在整个哺乳动物进化过程中发挥着完全相似的功能。这与先前的报导显示大脑基因表达变异在进化过程中受到高度限定是一致的。然而，大量的物种特异性基因表达被观察到，以前与小胶质细胞或人类小胶质细胞无关的一些途径也显示富集。研究者对人、猕猴和绒猴的分析显示，长寿和抗炎反应相关的通路表达更高；更具体地说是，DNA修复通路，铁死亡负调控和凋亡细胞清除。人类神经变性的许多特征涉及双链DNA损伤和衰老细胞的增加，以及铁的积累和多不饱和脂肪酸在CNS细胞中的过氧化作用。这些假定的长寿途径可以为人类等长寿动物体内的稳态小胶质细胞脑维持的分子基础提供一些线索。研究者的分析还显示，人类小胶质细胞表达了与AD和PD易感性相关的绝大多数基因（但不表达亨廷顿病或精神分裂症），而啮齿动物小胶质细胞只表达了这些基因的一小部分。
研究者鉴定了人类小胶质细胞的实质异质性，以及一个表达复杂SASP的小胶质细胞亚群，该SASP被认为在免疫细胞停留以清除衰老细胞方面发挥作用。SASP的调节与DNA损伤反应、免疫反应激活等多种途径有关。与任何涉及人体组织，特别是中枢神经系统的研究一样，在解释结果时必须谨慎。尽管研究者非常小心并仔细校准了样本采集和处理时间（STAR法），但不能排除患者的小胶质细胞不能准确地再现健康大脑的原位状态。尽管如此，对具有更广泛疾病范围（癫痫、脑肿瘤或急性缺血）的人和小鼠小胶质细胞的类似研究显示出非常相似的结果。这支持了研究者关于人类小胶质细胞异质性的论点，而在其他物种中没有观察到这种异质性。总之，研究者的分析确定了整个进化过程中的小胶质细胞基因程序。它还提供了一个基本的资源在一个大的进化范围来比较小胶质细胞，并对研究人员对小胶质细胞功能障碍介导的实验室疾病模型未来的发展和改进提供一定的指导。
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