科研 | 中国药科大学: 转录组学和代谢组学揭示了复方丹参片对高脂饮食喂养的小鼠异丙肾上腺素引起的心肌损伤的保护作用
编译：刘宁，编辑：十九、江舜尧。
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论文ID
原名：Transcriptomics and metabolomics reveal the cardioprotective effect of Compound Danshen tablet on isoproterenol-induced myocardial injury in high-fat-diet fed mice
译名：转录组学和代谢组学揭示了复方丹参片对高脂饮食喂养的小鼠异丙肾上腺素引起的心肌损伤的保护作用
期刊：Journal of Ethnopharmacology
IF：3.4
发表时间：2019.8.31
通讯作者：周伟、李佳
通讯作者单位：中国药科大学中药学院
DOI号：10.1016/j.jep.2019.112210
实验设计
本研究首先针对中药成分的复杂性对多批次的复方丹参片的成分进行分析鉴定，以保证书使用中药成分均一。
为了研究复方丹参片的作用机制将雄性C57BL/6J小鼠喂食高脂膳食喂养8周并口服复方丹参片（复方丹参片治疗组）或瑞舒伐他汀（阳性对照组），对照组喂食标准膳食8周。8周后将各组小鼠连续4周皮下注射异丙肾上腺素（ISO），用于研究复方丹参片保护高脂膳食小鼠异丙肾上腺素引起的心肌损伤的机制。
研究首先对心脏功能及组织病理学进行分析，进一步通过Illumina mRNA-Seq测序分析健康对照、心肌损伤动物模型以及复方丹参片治疗组的心脏，并通过定量实时聚合酶链反应（qRT-PCR）验证了复方丹参片对心血管疾病相关基因表达水平的恢复作用。最后研究使用气相色谱-质谱法对各组心脏内化合物的变化进行代谢组学分析。
图1. 研究复方丹参片潜在的心脏保护机制的策略
结果
1 复方丹参片成分均一且对心肌损伤具有保护作用
通过对11批复方丹参片成分的检测发现，质谱离子RSD小于30%的达到80%以上。同时鉴定出66种成分，包括不同类型的丹参酮（丹参酮II A，II B等）、丹酚酸（丹参酸A，B，C等）和人参皂甙（人参皂苷Rb1，Rd，Rg1等），RSD小于30％的大约85％。表明复方丹参片的质量是一致的。
与对照组相比，动物模型组（高脂膳食+ISO）出现左心室射血分数（EF）、左心室短轴缩短率（FS）和室间隔（IVS）显著下降，左心室质量（LV mass）、收缩期左心室容积（LV Vol；s）、舒张期室间隔（IVS；d）、收缩期左心室内径（LVID；s）显著增加，而复方丹参片与阳性对照瑞舒伐他汀作均可以逆转这些变化（图2A）。组织病理学结果表明，动物模型组小鼠心脏心肌纤维紊乱和细胞结构紊乱，在复方丹参片治疗组中结构紊乱减少（图2B）。此外，动物模型组心脏纤维化且α-SMA和TGF-β的mRNA水平增加，复方丹参片治疗可以显著抑制上述变化（图2C和D）。
图2. 复方丹参片对高脂膳食小鼠异丙肾上腺素诱导心肌损伤的保护作用。A：通过M型超声检查测得的心功能参数：射血分数（EF），短轴缩短率（FS），舒张期室间隔（LVS; s），舒张期室间隔（LVS; d），收缩期左心室内径（LVID; s），舒张期左心室内径（LVID; d），收缩期左心室容积（LVVol; s）和左心室质量（LV Mass）；B：H＆E染色的心脏组织切片的代表性显微照片；C：代表性的Masson三色染色的心肌切片（蓝色，疤痕组织；红色，存活心肌）。比例尺，100μm；D：α-SMA和TGF-β1表达的免疫组织化学检测；比例尺，100μm。
2 转录组分析
通过比较对照组和模型组共鉴定出13939个基因，其中与模型组相比，对照组中24个基因上调44个基因下调（图3A），主要参与色氨酸代谢、β-丙氨酸代谢、尼古丁成瘾和脂肪酸降解等（图3B）。通过比较对照组、模型组和治疗组，发现7个基因水平在复方丹参片治疗组得到了恢复，包括Prr141、Sprr1a、Ppp1r3c、Bmp10、Hspa1b、Pstpip2和Fcho2（图3C）。进一步利用q-PCR证实了与胰岛素和MAPK信号通路相关的4个与CVD相关的基因（Sprr1a，Ppp1r3c，Bmp10和Hspa1b）的mRNA水平（图3D）。
图3. 高脂膳食小鼠异丙肾上腺素诱发心肌损伤的心脏转录组学。（A）对照和模型组的火山图分析。（B）KEGG差异基因分析。（C）通过用复方丹参片处理恢复表达水平的基因热图。（D）与心脏保护作用有关的恢复表达水平的基因Q-PCR验证（n = 6）。
3 代谢组分析
应用GC-MS分析每组组织样品的代谢谱，共检测到2410个特征峰，其中770个特征峰显著改变。采用OPLS-DA可以明显区分对照组、模型组和复方丹参片组（图4A、B、C）。认定VIP值>1.0的代谢物是潜在的差异代谢物，在对照组与模型组之间鉴定出39种差异代谢物，在模型与复方丹参片组之间鉴定出37种差异代谢物。值得注意的是包括乳酸等32种差异代谢产物是共有的（表2），并且可能与CVD相关，可以通过复方丹参片恢复其水平（图4D）。热图显示复方丹参片可恢复21种差异代谢物含量（图4E）。32种差异代谢物的代谢途径分析发现其主要参与葡萄糖-丙氨酸循环、谷胱甘肽代谢和丙氨酸代谢等（图4F）。
图4.高脂膳食小鼠异丙肾上腺素诱发心肌损伤的心脏代谢组学。（A）对照组、模型组和复方丹参片组的OPLS-DA得分图；OPLS-DA模型验证进行了200次迭代的置换测试，证实OPLS-DA模型有效且没有过度拟合。（B）对照组和模型组的OPLS-DA得分图。（C）模型和复方丹参片组的OPLS-DA评分图。（D）重要差异代谢物的维恩图。（E）32种差异代谢物的热图。算术平均值的倍数变化（C代表对照组/模型组；T代表模型组/复合丹参片组）。两列颜色相似表示代谢物含量可以通过复方丹参片恢复。
表2. 从不同群体中鉴定出32种差异代谢物
讨论
中成药复方丹参片被长期用于治疗心血管疾病，然而由于其极其复杂的组成和多个作用靶标，使用传统药理学方法难以阐明其作用机理。本研究整合了转录组学和代谢组学，全面解析复方丹参片对高脂膳食小鼠异丙肾上腺素诱导心肌损伤的保护作用，发现复方丹参片可以恢复被扰动的代谢网络，为进一步研究潜在生物标志物及其作用机制奠定基础。
在代谢和转录水平上异常表达的几种改变的途径，包括丙酮酸代谢、烟酸和烟酰胺代谢、β-丙氨酸代谢和脂肪酸代谢（图3B和4E）。利用转录组发现复方丹参片治疗可使CVD诱导的Sprr1a、Ppp1r3c、Bmp10和Hspa1b等基因表达水平恢复或部分恢复正常，其中Hspa1b基因编码热激蛋白Hsp70，响应各种类型的应激刺激，包括炎性细胞因子、氧化应激、局部缺血或缺氧，且在CVD中HSP70表达水平升高。富含脯氨酸蛋白1A Sprr1a是受gp130信号通路调节的应激诱导蛋白，在生物力学/缺血应激性心肌细胞中被强烈诱导表达。Bmp10和Ppp1r3c也是在CVD中表达水平增加的相关标志性基因，而复方丹参片可以下调其表达水平。同样在代谢水平上，发现主要参与葡萄糖-丙氨酸循环、谷胱甘肽代谢和丙氨酸代谢的32种代谢物不同程度的受到了复方丹参片的影响，恢复或部分恢复到对照组水平。高脂膳食小鼠ISO诱导的心肌损伤模型中检测到葡萄糖代谢的紊乱，而复方丹参片的给药明显减弱乳酸、苹果酸和L-谷氨酸的上调，稳定葡萄糖代谢。进一步的体外模型将有助于发现心脏病理性或心脏保护作用的生物标志物。
结论
本研究利用转录组学和代谢组学揭示了复方丹参片对高脂膳食小鼠异丙肾上腺素引起的心肌损伤的保护作用。结果表明复方丹参片可恢复4种异常的CVD相关基因的表达水平，这些基因与胰岛素和MAPK信号通路相关；同时还调控了21种涉及葡萄糖、脂肪酸和氨基酸代谢的差异代谢物（图5）。研究结果为进一步的解析复方丹参片作用的分子机理提供线索。
图5. 复方丹参片的心脏保护机制。（A）转录组学和代谢组学研究；（B）葡萄糖和游离脂肪酸的能量代谢途径。（↑符号表示上调；↓符号表示下调；蓝色箭头代表模型与对照组的比例；红色箭头代表治疗与模型组的比例）。
评论
多年来，心血管疾病方面的预防及治疗已经取得了长足的进展，但发病率及死亡率仍不断上升，有效的预防治疗刻不容缓。中药作为我国预防和治疗心血管疾病的特有药物，其有效性和安全性得到了越来越多人的认同，但由于其成分的复杂性及作用的多样性成为阻碍中药发展的重大难题。中成药复方丹参片在心血管疾病的预防及治疗方面具有明确的疗效，其临床药理明确。在此基础上本研究利用转录组学和代谢组学联合，对复方丹参片治疗下的高脂膳食下异丙肾上腺素诱导的小鼠心肌细胞进行深入研究。研究挖掘了复方丹参片对心肌细胞相关基因及代谢途径的调控作用，为阐明其作用的分子机制奠定基础。借助多组学研究，表征中药多靶点、多途径的作用机制，可以将我国传统传统中药更好的运用于临床，发挥更大的作用优势。
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