科研 | 国人佳作：环状RNA circSLC8A1海绵miR-130b/miR-494通过调节PTEN抑制膀胱癌进展
编译：Tigobin，编辑：十九、江舜尧。
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环状RNAs (circRNAs) 是一类由共价闭环形成的新型内源性非编码RNAs，越来越多的证据表明circRNAs在基因表达调控中起着至关重要的作用。CircSLC8A1是由SLC8A1基因产生的circRNA。目前，circSLC8A1在膀胱癌中的作用和潜在的分子机制尚不清楚。本研究发现，circSLC8A1在膀胱癌组织和细胞系中表达下调，并且与膀胱癌的病理分期和组织学分级有关。CircSLC8A1过表达抑制了细胞在体内外的迁移、侵袭和增殖。从机制上讲，circSLC8A1可以直接与miR-130b/miR-494相互作用，进而作为miRNA海绵调节miR-130b/miR-494靶基因PTEN的表达及下游信号通路，从而抑制膀胱癌的发展。
论文ID
原名：Circular RNA circSLC8A1 acts as a sponge of miR-130b/miR-494 in suppressing bladder cancer progression via regulating PTEN
译名：环状RNA circSLC8A1海绵miR-130b/miR-494通过调节PTEN抑制膀胱癌进展
期刊：Molecular Cancer
IF：10.67（2018影响因子）
发表时间：2019年
通讯作者：郭宏骞
通讯作者单位：南京大学医学院附属鼓楼医院
DOI号：10.1186/s12943-019-1040-0
实验设计
从RNA测序数据中鉴定出差异表达的circRNA，并将circSLC8A1确定为一个新的候选circRNA。qRT-PCR法检测circRNAs、miRNAs和mRNAs在人体组织和细胞中的表达。采用RNA下拉实验和荧光素酶报告实验研究特异性circRNA、miRNA与mRNA之间的相互作用。体外和体内转染质粒，观察circSLC8A1对膀胱癌细胞的作用。Western blot检测PTEN的表达。通过划痕实验、Transwell实验和CCK-8实验检测其生物学作用。
结果
1. CircSLC8A1(hsa_circ_0000994)在膀胱癌中的表达显著下调
CircSLC8A1起源于SLC8A1基因，由外显子1(1832bp)的头尾拼接组成 (图 1a)。为探讨circSLC8A1在膀胱癌组织中的表达情况，研究人员检测了70对膀胱癌组织和正常膀胱组织中circSLC8A1的表达水平，结果证实circSLC8A1在膀胱癌组织中明显低表达 (图 1b)。值得注意的是，对膀胱癌肿瘤样本的配对分析显示，在所有患者样本中，circSLC8A1的表达减少的标本数超过80% (图 1c)。相关分析显示，circSLC8A1的表达与临床病理特征(包括病理分期和组织学分级)相关(表 1)。此外，circSLC8A1在6个膀胱癌细胞系(5637、T24、J82、EJ、UMUC和RT4)中的表达低于正常尿路上皮细胞系SV-HUC-1 (图 1d)。接下来，研究设计了聚敛引物来扩增SLC8A1 mRNA，发散性引物来扩增circSLC8A1。以5637和T24细胞的cDNA和gDNA(基因组DNA)为模板，circSLC8A1在cDNA中只被发散性引物扩增，而在gDNA中没有观察到扩增产物(图 1e)。通过qRT-PCR进一步证实circSLC8A1对RNase R具有抗性，而RNase R处理后的SLC8A1 mRNA显著减少(图 1f)。
图 1 CircSLC8A1在膀胱癌组织和细胞系中显著下调。a SLC8A1外显子1形成环状SLC8A1的示意图。RT-PCR证实了circSLC8A1的存在，Sanger测序证实了circSLC8A1的后剪接。红色箭头表示circSLC8A1的特殊拼接位点。b和c采用不同引物的qRT-PCR检测证实，70对人膀胱癌组织中circSLC8A1的表达水平均低于癌旁正常组织。d 用qRT-PCR检测circSLC8A1在SV-Huc-1和膀胱癌细胞系中的表达。e RT-PCR证实在5637和T24细胞系中存在circSLC8A1。发散性引物可在cDNA中扩增circSLC8A1，但在基因组DNA(gDNA)则不能。f 采用qRT-PCR方法检测RNase R处理前后5637和T24细胞中CircSLC8A1和SLC8A1mRNA的表达。
2. 过表达circSLC8A1抑制膀胱癌细胞的迁移和侵袭
鉴于本研究中circSLC8A1在膀胱癌组织和细胞系中表达下调，研究人员将circSLC8A1表达载体转染5637和T24细胞，并显著上调了circSLC8A1的表达(图 2a)。同时，SLC8A1 mRNA的表达无明显变化(图 2a)。细胞划痕实验显示，circSLC8A1的过表达显著抑制了5637和T24细胞的迁移(图 2b)。细胞侵袭和迁移实验一致表明，circSLC8A1的过表达也抑制了膀胱癌细胞系的迁移和侵袭能力。(图 2c和2d)。将针对circSLC8A1连接位点的siRNA转染5637和T24细胞。这些siRNA显著降低了circSLC8A1的表达，但对SLC8A1 mRNA没有影响(图 2e)。细胞划痕实验和Transwell分析表明，敲除circSLC8A1显著增加了5637和T24细胞的迁移和侵袭能力 (图2f-h)。
图 2 CircSLC8A1过表达抑制膀胱癌细胞的迁移和侵袭。a qRT-PCR检测转染circSLC8A1或对照载体质粒后5637和T24细胞中circSLC8A1和SLC8A1mRNA的表达水平。b 通过划痕实验观察circSLC8A1对5637和T24细胞迁移能力的影响。c and d 通过迁移和侵袭实验检测转染circSLC8A1和对照载体的5637和T24细胞的迁移和侵袭能力。e将两个针对circSLC8A1的siRNA转染5637和T24细胞。采用qRT-PCR检测各siRNA对circSLC8A1和SLC8A1mRNA的干扰效果。f 通过划痕实验，分别观察了circSLC8A1-1对5637和T24细胞迁移能力的影响，并用流式细胞仪检测了sIcSLC8A1-1对细胞迁移能力的影响。g and h 用迁移和侵袭实验检测转染si circSLC8A1-1或siNC的5637和T24细胞的迁移和侵袭能力。
3. circSLC8A1在膀胱癌细胞中作为miR-130b和miR-494的海绵
生物素标记的探针在5637、T24和SV-HUC-1细胞系中被证实能下拉circSLC8A1(图 3a和b)。检测了7个候选miRNAs的水平，结果表明在5637和T24细胞中miR-130b和miR-494是仅有的两个miRNAs能被circSLC8A1充分下拉(图 3c、d和e)。生物素标记的miR-130b/miR-494比生物素标记的阴性对照捕获了更多的circSLC8A1(图 3f和g)。此外，RNA FISH实验表明，circSLC8A1和miR-130b/miR-494共定位于细胞质中(图3h和i)。
图 3 CircSLC8A1在膀胱癌细胞中作为miR-130b和miR-494的海绵。a and b 将5637、T24和SV-HUC-1裂解产物中的circSLC8A1拉下，用circSLC8A1特异性探针富集，然后用qRT-PCR进行检测。C, d and e 用qRT-PCR检测5637、T24和SV-HUC-1裂解产物中7个候选miRNA的相对水平。在5637和T24细胞系中，circSLC8A1探针可以拖拽多个miRNA，并且miR-130b和miR-494都可以被circSLC8A1探针拖拽。f and g 将生物素标记的miR-130b或miR-494转染5637和T24细胞。链霉亲和素捕获后，用qRT-PCR定量检测circSLC8A1的水平。h and i RNA FISH实验检测T24中circSLC8A1和miR-130b/miR-494的共定位情况。细胞核染成蓝色(DAPI)，circSLC8A1染成红色，miR-130b/miR-494染成绿色。
4. miR-130b和miR-494通过靶向PTEN促进膀胱癌进展
qRT-PCR结果显示，与正常膀胱组织相比，膀胱癌组织中miR-130b和miR-494表达上调(图 4a和b，表2)。相关分析显示，circSLC8A1的表达与miR-130b或miR-494呈负相关(图 4c和d)。过表达miR-130b和miR-494显著促进了5737和T24细胞的增殖(图 4e和f)。Transwell分析表明，miR-130b或miR-494的过表达显著促进了5637和T24细胞的迁移和侵袭(图 4g和h)。相反，转染miR-130b/miR-494抑制剂明显抑制5637和T24细胞的迁移和侵袭(图 4i和j)。根据TargetScan (http://www.targetscan.org/) 和Miranda预测，研究者发现miR-130b和miR-494都能与PTEN的3’-UTR区域结合(图 4k)。接下来，进行荧光素酶报告分析来验证这种相互作用。结果表明，与模拟物NC相比，转染miR-130b或miR-494模拟物可显著降低携带野生型PTEN 3’-UTR的荧光素酶报告基因的活性。相反，突变的荧光素酶报告不受miR-130b或miR-494过表达的影响(图 4l)。Western blot分析表明，miR-130b或miR-494模拟物可以抑制PTEN的表达(图 4m)。
图 4 miR-130b和miR-494通过靶向PTEN促进膀胱癌进展。a and b qRT-PCR结果显示，30例膀胱癌组织中miR-130b和miR494的表达均高于癌旁正常组织。c and d 皮尔逊相关分析提示circSLC8A1的表达与miR-130b/miR-494呈负相关。e and f CCK-8实验显示miR-130b和miR-494对5637和T24细胞的增殖有促进作用。g and h 迁移和侵袭实验表明，转染miR-130b或miR-494模拟物的5637和T24细胞的迁移和侵袭能力增强。i and j 转染抗miR-130b或抗miR-494可抑制5637和T24细胞的迁移和侵袭。k 生物信息学分析预测miR-130b/miR-494结合位点在PTEN mRNA 3’-UTR中。l 荧光素酶报告实验证实miR-130b/miR-494与PTEN mRNA的相互作用。m miR-130b和miR-494分别降低PTEN蛋白表达水平。
5. CircSLC8A1通过靶向miR-130b和miR-494调节PTEN表达并抑制膀胱癌进展
CircSLC8A1的过表达导致膀胱癌细胞的侵袭和增殖能力受到抑制，但这种作用可以被miR-130b或miR494的异位表达部分减弱(图 5a，b和c)。此外，我们还发现，与单独转染circSLC8A1质粒的细胞相比(图 5d和e)，共同转染circSLC8A1质粒和miR-130b/miR-494模拟物的膀胱癌细胞中PTEN的表达明显降低，这与细胞功能的结果一致。此外，膀胱癌组织中PTEN蛋白的表达水平明显低于癌旁组织(图 5f)。上述结果表明，circSLC8A1通过海绵miR-130b/miR-494和调节PTEN的表达来抑制膀胱癌的进展。
图 5 CircSLC8A1通过靶向miR-130b和miR-494调节PTEN的表达，抑制膀胱癌的进展。a, b and c Transwell侵袭和CCK-8检测显示，CircSLC8A1抑制5637和T24细胞的侵袭和增殖，当与miR-130b或miR-494共转染时，抑制作用被逆转。d and e Western blot结果显示，miR-130b和miR-494可部分降低circSLC8A1促进的PTEN蛋白表达水平。f 10对人膀胱癌组织及癌旁正常组织中PTEN蛋白的Western blot分析。
6. CircSLC8A1体内抑制膀胱癌肿瘤生长的实验研究
裸鼠皮下注射癌细胞后每周测量肿瘤体积。与对照组相比，circSLC8A1过表达组的生长速度和肿瘤重量显著降低(图 6c和d)。在circSLC8A1过表达组中，circSLC8A1表达水平上调，然而根据qRT-PCR结果，miR-130b和miR-494水平下调(图 6e)。IHC分析表明，通过过度表达circSLC8A1(图 6f)，PTEN在肿瘤中的表达增加。这些结果表明，circSLC8A1过表达能有效地抑制膀胱癌的体内生长。
图 6 CircSLC8A1在体内对膀胱癌肿瘤的生长有抑制作用。a 将稳定转染circSLC8A1或对照载体的T24细胞皮下注射至裸鼠皮下，建立皮下移植瘤(n=6)。b 裸鼠异种移植瘤形成示意图。c and d 与空白载体组相比，circSLC8A1处理组裸鼠的肿瘤生长率和重量均显著降低。e采用qRT-PCR方法检测肿瘤组织中circSLC8A1、miR-130b和miR-494的表达水平。f 免疫组化染色检测移植瘤中PTEN、AKT、p-AKT和MMP9的表达。
结论
综上所述，研究结果表明，circSLC8A1在膀胱癌组织和细胞系中表达下调，并且它能够作为miR-130b和miR-494的海绵来调节PTEN的表达。此外，还证明了通过靶向miR-130b、miR-494/PTEN轴，circSLC8A1的过表达可以有效地抑制膀胱癌的进展。研究结果不仅解释了circRNA调控膀胱癌细胞生长的机制，而且为膀胱癌的治疗提供了一个潜在的生物标志物和治疗靶点。
评论
膀胱癌是泌尿系统最常见的恶性肿瘤，也是全世界最常见的恶性肿瘤之一。在我国，膀胱癌的死亡率和发病率均居泌尿系统肿瘤的首位。因此，阐明膀胱癌发生发展的分子机制，有助于开发更有效的抗癌治疗方法，具有重要的临床意义。对RNA测序数据的全基因组分析已经确定了大量的circRNAs，并证明它们在哺乳动物细胞中是内源性的、丰富的和保守的，这表明了circRNAs在细胞生理学中的特殊作用。本研究鉴定了一个来源于SLC8A1基因的circRNA，命名为circSLC8A1。CircSLC8A1在膀胱癌组织和细胞系中的表达明显下调，并与膀胱癌的临床分期和分级呈正相关。因此，作者提出了一个假设，认为circSLC8A1可能通过海绵miR-130b和miR-494来影响PTEN的表达，从而参与调控膀胱癌的进展。总的来说，circSLC8A1可能成为膀胱癌治疗的一个有希望的靶点。
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