怎样阅读质粒图谱?
第一步,查看质粒图谱上的箭头标识:
多数质粒图谱上都会有箭头标识:一种是转录方向,转录方向主要是由启动子开始的一个大箭头,是启动子启动序列的顺序。另一种是复制起始位点的方向,复制起始位点就是该质粒在大肠杆菌等细菌或真菌中DNA复制的一个方向。了解转录的方向,这样就方便设计插入片段的位置和方向性。 质粒图谱上有的箭头顺时针有的箭头逆时针,是指两条DNA链,即质粒是环状双链DNA,它的启动子等在其中一条链上,而它的抗性基因在另一条链上 .根据表达宿主不同,构建时所选择的载体也会不同。
第二步,看质粒图谱上的标签:
Ori:DNA 复制起始位点,原核生物DNA分子中只有一个复制起始点。而真核生物DNA分子有多个复制起始位点。
P:启动子,这个质粒上用的是一个CMV启动子,来启动后面的表达蛋白。常见的启动子有:CMV、EF1,H1、U6等。
R:抗生素抗性基因,最常见的是:Amp(氨苄青霉素)、Kan(卡那霉素)、Tet(四环素,tet on/tet of)、Cmr(氯霉素)、SM(链霉素)、Hyg(潮霉素)。
pA:即转录终止位点poly A,可以起到稳定mRNA作用。
报告基因:常见的有copGFP(绿色荧光蛋白),Puro(嘌呤霉素),Lacz(乳糖操纵子)等等。和抗性基因不同,这样的报告基因,并不是为了在大肠杆菌扩增质粒的过程中起作用的。而是在质粒转入表达体系后起到作用的,基本上就是为了显示过表达或是敲减的基因是否正常运作。有的报告基因会融合在蛋白中表达,有的会另外用一个独立的启动子进行表达(比如shRNA的质粒中)。
其他:包括一些调控元件和目的蛋白。
第三步,看质粒图谱的多克隆位点(MCS):
MCS(Multiple Cloning Site),一般图中会把多克隆位点上的酶切位点都标记出来。上面的酶切位点顺序,一般都是按照5`-3`的顺序排列下来的,需要注意的是这样几点。
第一,有些酶切位点边标注了*的一般是指并不仅仅存在一个位点,也就不能用来作为构建质粒的酶切位点。
第二,有的酶切位点,在序列中只有一个,但也标注了一个*或者(dam),这说明可能这个酶切位点会有CpG岛的甲基化修饰,一般也是不能用的。但是非要用这个酶切位点的话,就需要用非甲基化的感受态细胞,如JM109或者JM110。
第四步:外源DNA插入片段大小
质粒一般只能容纳小于10Kb的外源DNA片段。一般来说,外源DNA片段越长,越难插入,越不稳定,转化效率越低。
第五步:是否含有表达系统元件
即启动子-核糖体结合位点-克隆位点-转录终止信号。这是用来区别克隆载体与表达载体。克隆载体中加入一些与表达调控有关的元件即成为表达载体。选用那种载体,还是要以实验目的为准绳。
启动子-核糖体结合位点-克隆位点-转录终止信号
启动子-促进 DNA 转录的 DNA 序列,这个 DNA 区域常在基因或操纵子编码序列的上游,是 DNA 分子上可以与 RNApol 特异性结合并使之开始转录的部位,但启动子本身不被转录。
增强子/沉默子-为真核基因组(包括真核病毒基因组)中的一种具有增强邻近基因转录过程的调控顺序。其作用与增强子所在的位置或方向无关。即在所调控基因上游或下游均可发挥作用。
核糖体结合位点/起始密码/SD 序列(Rbs/AGU/SDs):mRNA 有核糖体的两个结合位点,对于原核而言是 AUG(起始密码)和 SD 序列。
转录终止序列(终止子)/翻译终止密码子:结构基因的最后一个外显子中有一个 AATAAA的保守序列,此位点 down-stream 有一段 GT 或 T 富丰区,这2部分共同构成 poly(A)加尾信号。结构基因的最后一个外显子中有一个 AATAAA 的保守序列,此位点 down-stream 有一段GT 或 T 富丰区,这2部分共同构成 poly(A)加尾信号。