细胞穿膜肽修饰的纳米线向原代神经元细胞内的自发运输

摘要：半导体纳米线（NW）器件能够以高灵敏度和高空间分辨率呈现细胞内的电生理学过程，是纳米生物电子学中的重要工具。然而，在不依靠外界提供的机械力或电脉冲的情况下，将NW运输进细胞内而不破坏细胞完整性和代谢活性是十分困难的。在本文中，作者介绍了一种通过将细胞穿膜肽——一种从人类免疫缺陷病毒1中分离出的反式激活转录激活剂（TAT）与硅纳米线（Si NW）表面相连接，从而促使NW自发进入原代神经元细胞的生物学方法。固定时间点的共聚焦显微镜成像研究表明，与细胞穿膜肽结合的纳米线（TATNW）可以完全进入到小鼠海马体神经元细胞中，定量图像分析表明进入比例约为15%。另外，活细胞动态成像显示，NW进入细胞的过程在NW与细胞膜接触后的10到20分钟以内开始，在30至40分钟以内完成。通过使TAT-NWs进入原代背根神经节（DRG）神经元，作者进一步说明了细胞穿膜肽修饰方法的普遍适用性。背景与目的纳米材料在生物电子学中有广泛的应用。在传感领域，纳米器件的表面修饰已得到很好的应用，其中受体的连接对于选择性检测至关重要。然而，在神经细胞中，很难在不影响细胞活性的情况下，将Si NW装置穿过细胞膜输送至细胞内部。常用的方法是利用外部的机械力或电脉冲来实现Si NW的跨膜运输。另外，仿生学研究表明，利用细胞膜样磷脂对Si NW进行表面修饰，可以促进Si NW的跨膜运输，但将这一方法用于神经细胞的成功案例还未见报道。在本文中，作者介绍了一种利用细胞穿膜肽对Si NW进行表面修饰，在不影响细胞活性的情况下，实现Si NW向神经细胞内自发运输的方法。实验原理1.利用共聚焦显微镜成像技术，可以获得细胞的俯视图或横截面视图。在实验之前对细胞核、细胞膜、NW分别用不同颜色的荧光进行标记，便可以通过在共焦显微镜图像中通过观察荧光，得到三者的相对位置关系，从而确定NW是否进入了细胞内部。2.利用沿同一方向的横截面上的一系列共聚焦显微镜图像，可以通过曲面重建方法重建细胞表面的图像（如图1a-i），在这种图像中，只有在细胞膜外面的NW是可见的（如图1a-ii）。随后，获取NW的荧光通道图像（如图1a-iii），并与重建的细胞表面图像进行对比：在两种图像中均可见的NW处于细胞外，而仅在荧光通道图像中可见的NW处于细胞内。例如，在图1-b中，白色箭头所指的NW进入了细胞内部。3.在重建的细胞表面图像中可以对NW的数目进行定量图像分析。分别统计图像中处于细胞外的NW和处于细胞内的NW数量，可以从统计的角度对进入细胞的NW的占比进行分析。4.利用活细胞动态成像技术，每间隔一定时间对细胞样品进行一次共聚焦成像，获得一系列时刻中NW与细胞膜的相对位置信息，从而得到NW向细胞内运输的动态过程。过程与结果首先，作者通过纳米金原子簇催化的气液固法合成了Si NW，随后用(3-氨基丙基)-三乙氧基硅烷处理，得到一级胺封端的单层膜，再用1-乙基-3-(3(二甲氨基)丙基)碳二亚胺将荧光标记物STV与一级胺单层膜连接，最后在TAT溶液中处理，得到TAT表面修饰的TAT-NW。将小鼠海马体细胞培养2周后，将5 μg TAT-NW放置于样品中，在37 ℃下培养20小时，并用TAT修饰的STV-NW以相同的方式做对照实验。作者利用共聚焦显微镜成像技术对样品进行了观察，发现被TAT修饰的NW可以进入神经细胞，而未被修饰的STV-NW则没有进入细胞。

随后，作者通过曲面重建方法，将一系列共聚焦显微镜图像重建为细胞表面的图像，并与NW的荧光通道图像进行对比。作者运用定量图像分析的方法对细胞内、外的NW数量进行了统计，发现进入细胞的NW的占比为14.9 %。即运用此方法，进入细胞的NW占NW总数的比例在14.9 %左右。

为了运用活细胞动态成像技术进行观察，作者设计了如图2-a所示的培养皿，将物镜从洞中插入，实现了对样品的实时观察。作者在100倍放大下，每隔10分钟进行一次共聚焦显微镜成像，得到了如图2-b的结果。图像表明，NW进入细胞的过程在NW与细胞膜接触后的10到20分钟以内开始，在30至40分钟以内完成。为了检测这一方法的普适性，作者利用原代背根神经节（DRG）细胞进行了相同的实验，得到了与在海马体细胞中相似的实验结果：被TAT表面修饰的NW可以自发进入细胞内，且NW进入细胞内的过程在NW与细胞膜接触后的10分钟以内开始，在30分钟以内完成。结论与意义作者经研究证实：利用细胞穿膜肽对Si NW进行表面修饰，可以在不影响细胞活性的情况下，实现Si NW向神经细胞内的自发运输。作者利用共焦显微镜成像、曲面重建方法、定量图像分析、活细胞动态成像对运输的进入比例、动态过程进行了研究，并通过使TAT-NWs进入原代DRG神经元的实验，说明了细胞穿膜肽修饰方法的普适性。这种仿生方法有希望在作为生物传感器和细胞探针的半导体NW器件中得到应用，从而以高度定位和靶向的方式记录细胞内电位和生化信号。评论与体会1.本文是对一种有应用价值的分析方法的探究。从这篇文章中，我初步了解了探究出一种新分析方法的思路。一种新的分析方法需要设计实验来研究其可行性和分析效果，并需要对这种方法的原理、机理进行尽可能详细的了解。2.作者在对小鼠海马体细胞进行实验后，又对原代DRG神经元细胞进行了重复实验来验证分析方法的普适性。这启示我们：分析化学作为一门严谨的学科，相同的分析方法对于不同的样品而言，未必能够达到理想的预期效果。3.这项工作中运用了仿生学的思想。仿生学作为一门边缘、交叉学科，是科研的前沿之一。我们应该在学习和未来的科研中，提高自己的观察能力，从一些生物学现象中找到解决问题的灵感。4.“21世纪是生物学的世纪”，作为未来的化学工作者，我们应该对前沿交叉学科多加关注，打好生物学、物理学的知识基础。