【LorMe周刊】噬菌体杀手——次级代谢产物
作者：侯如娇，南京农业大学硕士在读。主要研究利用噬菌体防治土传病害。
细菌宿主与噬菌体之间的军备竞赛推动了细菌抵抗噬菌体系统的不断进化，抗噬菌体系统具有不同的防御机制。本研究在链霉菌中发现了一种广泛存在的化学抗噬菌体防御系统。试验探究分析了链霉菌产生的次级代谢产物，从中找到一些具有DNA插入功能的物质，并设计试验证明这些代谢物质对噬菌体具有抑制作用，进一步揭示潜在的分子机制。由于双链DNA噬菌体是生物圈中数量最多的类群，且细菌产生次级代谢产物的现象非常普遍，这种抗噬菌体防御机制可能在细菌群落进化以及细菌-噬菌体共存方面着重要作用。
一、小分子物质抑制噬菌体复制
采用高通量分析法筛选了4960种化合物，包括天然产物、FDA批准的药物和已知的生物活性分子，以确定能保护大肠杆菌不被噬菌体裂解的化合物（图1a）。试验先将细菌在每种化合物（混合）存在下培养一小时。然后加入高感染倍数的噬菌体，监测细菌生长5小时。结果发现在没有化合物的情况下，细菌在加入噬菌体后两小时内完全裂解（图1a），在大多数被测化合物存在下的情况下也观察到了噬菌体裂解细菌（图1b）。然而，进一步试验发现在11种化合物下观察到细菌生长，表明这些化合物能够阻止噬菌体复制，从而使细菌存活（图1c）。值得注意的是，11个化合物中有9个是DNA插入剂，其中4个化合物柔红霉素、阿霉素、表阿霉素和伊达柔比星属于一类被称为蒽环类的分子，蒽环类是链霉菌（一种广泛分布的土壤细菌）自然产生并首先从链霉菌中分离出来的次生代谢产物。其他插入分子包括合成蒽环类、生物碱、荧光色素和吖啶族化合物。剩下的化合物一种是二苯并咪唑和一种能增加细菌细胞通透性的季铵盐氯化物。
图1 小分子物质抑制噬菌体增殖
二、链霉菌产生的次级代谢产物对噬菌体的抑制
Streptomyces（链霉菌）能产生大量不同的次级代谢产物，在筛选能阻止噬菌体复制的化合物时，鉴定了两种链霉菌的次级代谢产物柔红霉素和阿霉素。为了确定柔红霉素和阿霉素是否真的能在野生环境中保护链霉菌逃避噬菌体捕食，试验收集了12个不同地理位置的尾状病毒目链霉菌噬菌体，在没有药物的情况下，12个噬菌体能够快速地繁殖。在10μM柔红霉素或阿霉素存在下，抑制噬菌体复制达到105倍或更多（图2a）。这表明阿霉素和柔红霉素在同一生物合成途径中产生，只有一个羟基不同，它们都能保护链霉菌免受噬菌体捕食。
接下来培养链霉菌1、2、3和4天以诱导产生抑制噬菌体复制的物质。通过质谱分析，作者确认在剩余培养基中存在阿霉素和柔红霉素（图2b）。过滤菌液后在过滤液中加入新的培养基、宿主S. coelicolor spores和噬菌体Scoe2混合培养过夜，然后测定了每个样本中噬菌体的数量。结果发现第3天和第4天的剩余培养基强烈抑制噬菌体复制，细菌细胞生长没有明显影响。
由此看来，链霉菌分泌这些代谢物质抵抗噬菌体有利于提高他们的适应性，那么这种能力在链霉菌种中是普遍现象？还是具有特异性？作者从Wright Actinomycete Collection放线菌群（WAC）的48株链霉菌中提取了小分子物质，测试了它们阻止有不同宿主范围的两种噬菌体复制的能力。结果发现大约30%的提取物（14/48）抑制了一个或两个噬菌体复制达到104倍，不会抑制细菌生长。随后，用14种提取物对12个链霉菌噬菌体进行了测试，发现一些提取物（例WAC240）强烈抑制所有被测噬菌体的复制，而其他提取物（例WAC303和WAC212）仅强烈抑制一些噬菌体（图2c）。这些数据表明链霉菌产生抗噬菌体次级代谢产物是普遍现象，但次级代谢产物种含有的抗噬菌体物质不同。
图2 链霉菌产生的次级代谢产物抑制噬菌体复制
三、次级代谢发挥作用机制探究
不同次级代谢产物如何抑制噬菌体复制？试验选择了一种具有广泛抗噬菌体活性的提取物（WAC240）和另一种仅抑制部分噬菌体的提取物（WAC288），从提取物中分离出活性代谢物并进行质谱分析。结果发现WAC288的活性部分含有cosmomycin D，一种与柔红霉素一样可以紧密地嵌入dsDNA的蒽环类化合物。WAC240中的活性化合物是actinomycin D，也具有DNA插入活性，但不是蒽环类。对其余十二个提取物的小分子分析发现DNA插入化合物在噬菌体抑制提取物中频繁出现，表明DNA插入可能是阻断噬菌体复制的一种特别有效的方法。
两种差异很大的菌种如何通过DNA插入抑制噬菌体的复制？由于链霉菌噬菌体分析系统的技术限制，评估了柔红霉素对大肠杆菌噬菌体复制的影响。使用钾外流试验来测试柔红霉素存在和不存在的情况下噬菌体将其DNA注入宿主细胞的能力（图3a）；钾释放与噬菌体基因成功进入细菌细胞有关。结果在这两种情况下均观察到钾释放（图3b），表明药物不能阻止噬菌体基因组进入细胞。此外，在柔红霉素存在下诱导原噬菌体（噬菌体基因组整合到细菌染色体）不会减少噬菌体颗粒的释放（图3c），表明代谢物不会抑制噬菌体复制、蛋白质合成或病毒颗粒的组装。最后，检测了噬菌体作为溶原整合到细菌染色体的能力，利用高度多重感染，使细菌细胞在没有柔红霉素的情况下100%溶原化。结果发现在柔红霉素存在的情况下噬菌体溶原形成减少了70%（图3d）。这些实验表明柔红霉素阻断了DNA注入后DNA复制前的一个非常早期的步骤。此外，研究发现柔红霉素对所有类型的dsDNA噬菌体，包括长尾、肌尾和短尾家族的噬菌体都有抑制作用，而单链DNA（ssDNA）噬菌体M13则没有。测试了两个铜绿假单胞菌噬菌体发现柔红霉素对这些噬菌体复制也有抑制。
图3 柔红霉素影响噬菌体复制机制
自然界中细菌抗噬菌体防御系统具有多样性和广泛性，本文研究发现链霉菌通常产生次级代谢产物，为它们提供化学抗噬菌体防御。与其他抗噬菌体系统不同，链霉菌产生的次级代谢物是DNA插入化合物，可以阻断噬菌体早期阶段的复制，此外这种物质可以为抵抗所有dsDNA噬菌体的细菌提供广泛的保护。由于许多次级代谢产物是已知的可扩散分子，在细菌群落中可以提供一个先天的防御系统来保护整个群落。对细菌产生的次级代谢产物中抗菌化合物的鉴定分析可能会发现一些新的抗噬菌体类生物活性化合物，具有广泛的治疗用途。因此，对这些代谢物及其作用机制的进一步研究将发现独特的化学物质，扩大我们对细菌抗噬菌体防御系统的认识，发现细菌-噬菌体军备竞赛的更多奥秘。
论文信息
原名：A chemical defence against phage infection
译名：抗噬菌体感染的化学防御
期刊：Nature
发表时间：2018.12
通讯作者：Karen L. Maxwell
通讯作者单位：多伦多大学生物化学系