【分析】Anal. Chem.：一种恶性疟原虫疟疾快速超灵敏检测方法
恶性疟原虫（Plasmodium falciparum）疟疾在世界热带和亚热带地区普遍存在，据统计，2018年恶性疟原虫疟疾估计造成405,000人死亡。疟疾通常使用侧流（LF）原理利用显微镜或快速诊断测试（RDT）进行诊断。显微镜检查是疟疾诊断的历史标准方法，而RDT目前是资源贫乏地区最受欢迎的诊断方法。RDT比显微镜更易于使用，不需要熟练的技术人员，并且可以快速产生结果。RDT检测恶性疟原虫的主要分析物是恶性疟原虫富组氨酸蛋白-2（PfHRP2）。HRP2在寄生虫的滋养体阶段表达，但由于该蛋白的半衰期较长，可以在整个感染过程中检测到该目标物。目前人们正在努力消除世界上大部分流行地区的疟疾，对低密度感染的准确、快速诊断是消除计划的关键组成部分。因此，开发灵敏的即时护理（POC）诊断测试来诊断无症状个体中的恶性疟原虫具有重要意义。
近期，印度国家转化健康医学和技术研究所（THSTI）的Gaurav Batra及合作者报道了一种高灵敏且功能强大的试纸条，用于检测恶性疟原虫感染。该试纸条是基于上转换荧光纳米材料侧流（UCNP-LF）来进行免疫测定的。通过使用包含不同寄生虫密度的全血样本参考板对UCNP-LF试纸进行测试，将检出限与WHO认证的快速诊断测试进行比较，UCNP-LF的检出限为0.2-2寄生虫/μL，其分析灵敏度提高了50到250倍。该UCNP-LF在40 °C的环境下具有很高的稳定性。经过优化的UCNP-LF检测方法与常规疟疾RDT一样简单，仅需5 μL全血作为样品。加入样品20分钟后，可以使用简单的光致发光读取器读取结果，一般情况下测试和控制线路信号至少可以稳定10个月。另外，UCNP-LF具有对有症状和无症状个体进行诊断测试的能力。相关成果以“Ultrasensitive and Robust Point-of-Care Immunoassay for the Detection of Plasmodium falciparum Malaria”为题发表在国际化学权威杂志Analytical Chemistry上（DOI: 10.1021/acs.analchem.0c02748）。
图一、UCNP-LF免疫检测HRP2抗原的原理图。
（来源：Analytical Chemistry）
首先，作者设计与开发了UCNP-LF试纸条。该试纸条包括一个塑料背衬层压板、硝酸纤维膜（其测试线和对照线之间的距离为5 mm）、结合垫（包含干燥的示踪抗体-UCNP缀合物）、一个吸收垫以及塑料外壳。作者将示踪抗体与活化UCNP颗粒在合适的pH值缓冲液中缀合，并在UCNP-LF分析中测试了每种缀合物的HRP2抗原检测。将UCNP-LF条带与12种不同类型的硝酸纤维素膜组装在一起，用于检测HRP2抗原，并将性能进行比较。根据结果，选择芯吸速率较快的硝酸纤维素膜用于构建试纸条平台。总体而言，随着更快的芯吸速率膜的增加，信噪比和信号电平也有所提高。在最后的开发步骤中，将UCNP缀合物的量优化为10 ng/strip。较多数量的UCNP缀合物会增加检测条的背景信号，从而导致较差的信噪比。
图二、UCNP-LF检测的光致发光强度条分布。
（来源：Analytical Chemistry）
接着，作者将开发的UCNP-LF与常规RDT的性能进行了比较。将优化后的UCNP-LF与WHO认证的常规RDT（使用胶体金纳米颗粒作为视觉标签）进行了性能比较，使用包含来自八种不同菌株的恶性疟原虫的两个全血板用于评估测试。测试结果显示，UCNP-LF的HRP2检测限对于其中5个菌株为12 pg/mL，对于W2菌株为40 pg/mL；常规RDT的检出限对于其中4个菌株为800 pg/mL，对于FCQ79和婆罗洲菌株为400 pg/mL。UCNP-LF的检出限取决于菌株，为0.2-2寄生虫/μL。当用肉眼或移动式阅读器评估试纸条时，常规RDT的检出限在10-100寄生虫/μL之间变化，具体取决于菌株。当用肉眼或移动阅读器读取试纸时，与传统RDT的灵敏度没有显着差异。研发的UCNP-LF将广泛使用的HRP2单克隆抗体对作为结合物。但与现有RDT相比，UCNP-LF测试灵敏度的显着提高可能是由于使用了UCNP标签代替了颜色标签。与标准RDT相比，超灵敏RDT（uRDT）的感染检出率高出了2倍。尽管与常规RDT相比，uRDT的灵敏度有了显着提高，但在实际应用时仍需要进行更加灵敏的快速检测，本研究开发的UCNP-LF可以满足该需求。
最后，作者评估了上转换纳米荧光标签的优势。LF分析中HRP2灵敏度的提高是由于标记物从RDT的金纳米颗粒变为UCNP。UCNP作为侧流免疫分析标签具有多个优势：UCNP通过多光子激发和长寿命的磷光发射将长波长红外辐射上转换为较短波长的可见光；由于上转换是UCNP所特有的，激发和发射波长之间的反斯托克斯位移很大，并具有尖锐的结构化发射峰，因此背景荧光几乎没有。与紫外线激发相比，红外线激发辐射具有更好的生物材料渗透性，并且已证明UCNP标签在无色血浆和全血中表现相同。消除自发背景荧光可实现UCNP的高度灵敏检测。由于UCNP标签是光致发光颗粒，具有很高的光稳定性，UCNP-LF试纸可以在进行测试后长期保存。UCNP-LF测试可以在20分钟后的任何时间读取，也可以在干燥时读取。在进行测试后10个月重新测量试纸条，以及对相同试纸条重复测量20次，结果显示测试的灵敏度或特异性没有下降。该策略也可用于其他病原体，这对于诊断和监测的发展具有重要意义。
图三、测试10个月后，UCNP-LF试纸条的光致发光强度图。
（来源：Analytical Chemistry）
小结：作者报道了一种高灵敏且功能强大的试纸条，用于检测恶性疟原虫感染。与标准RDT相比，UCNP-LF试纸条用于快速检测恶性疟原虫HRP2的灵敏度可以最高提高250倍。新开发的检测方法与常规RDT一样快速且易于使用，并且可能适用于在实际环境中检测到低寄生虫感染的无症状患者。该检测方法适用于高灵敏度检测，包括其他病原体的抗原，可用于常规检查和监测。这为开发简单、便捷、准确的检测试纸条用于病原体的测定提供了新的思路。