意识阑珊处，巧辨隐球菌
(01)
新型隐球菌，墨汁染色，400×。[2]
印度墨汁常用来观察黑暗背景下透明的荚膜，因为这种墨汁不能透过荚膜，表现出围绕酵母菌的清晰透明的光环。红细胞或淋巴细胞等伪影，或手套上的滑石粉出现，都会导致光环效应。因此，仔细检查存在的酵母细胞和出芽的形成是必不可少的。[1]
各参考书籍关于隐球菌的形态描述：
11版《临床微生物学手册》：
隐球菌是圆形、有时是椭圆形的酵母样真菌，形态变异很大，直径3.5～8μm或更大。单极出芽，在母体和子细胞之间有缩窄的颈。有时能看到多个芽、很少能见到假菌丝。[1]
《临床微生物学诊断与图解》：
菌体呈球形或椭球形，菌体较大，直径一般为4～10μm(格特隐球菌偶见针形或梭形菌体)。墨汁染色可见菌体周围包裹有肥厚的荚膜，菌体可见多边芽殖，但无菌丝或假菌丝。[2]
《临床脑脊液细胞学诊断》：
墨汁染色，光镜下可见黑色背景下透亮的隐球菌。菌体多呈圆形，出芽菌体呈葫芦状或哑铃状，荚膜较宽。直径5～20μm不等。[3]
《医学重要真菌鉴定指南》：
酵母细胞：1、直径为2～20μm（通常4～10μm）；2、显微镜下大小不一；3、可为卵圆形，但是多数为典型的薄壁圆形；4、在较窄的基底处出芽；5、产生特征性的肥厚荚膜，偶尔会出现细胞周围荚膜不完整的情况。[4]
小编：几本参考书，都不约而同提及到一点，圆形或椭圆形的菌体、大小悬殊。“大小悬殊”这一特点，很重要。它是隐球菌与耶氏肺孢子菌的一个重要鉴别点，前者大小悬殊，后者大小均一。
隐球菌，脑脊液，革兰染色1000×。圆形菌体，有宽厚荚膜。单极出芽，在母体和子细胞之间有缩窄的颈（箭头示）。
形象记忆：“藕断丝连”。
隐球菌，脑脊液，抗酸染色1000×。圆形菌体，宽厚荚膜。
隐球菌，脑脊液，美兰染色（湿片）400×。（广西贺州市人民医院-梁立全老师 提供。）
能想到用美兰染色，打破常规定式思维，本就很不寻常。更重要的是，一张美兰染色的图，囊括了墨汁染色镜下该有的特征。
宽厚荚膜，单极出芽，菌体内有反光孢子，大小不一的菌体，保持等距离分布。用"惊艳"都不足以形容它的美。
(05)
隐球菌，脑脊液，瑞姬氏染色1000×。成堆的隐球菌，大小不等。（以红细胞作为标尺，7μm）
《临床脑脊液细胞学诊断》瑞姬氏染色镜下形态：
菌体圆形，直径5～20μm不等，常于菌体上长出较小的芽孢而呈葫芦状或哑铃状。菌体数量多时常成堆，成簇排列，为紫红色，无核，周边染色较深，由于菌体荚膜不着色，故大小不等的菌体间保持等距离分布。[3]
隐球菌，脑脊液，瑞姬氏染色1000×。成堆的隐球菌，荚膜不着色，等距分布。
脑脊液，瑞姬氏染色1000×。1、被吞噬的隐球菌。2、隐球菌吞噬细胞。
隐球菌脑膜炎的脑脊液细胞学表现：
早期多呈混合细胞学反应或以淋巴细胞反应为主的混合细胞学反应，少数可呈以嗜中性粒细胞反应为主的混合细胞学反应，可见成堆出现的隐球菌。积极治疗后，隐球菌数目减少，以单核-吞噬细胞反应为主，可见隐球菌吞噬细胞，说明治疗有效。[3]
隐球菌，脑脊液，革兰染色1000×。“藕断丝连”。（运城市中心医院 提供）
(09)
隐球菌，脑脊液，阿利新兰染色1000×。（图片来自 网易博客“一滴水折射一个世界”，脑脊液细胞研究室。）
阿利新兰染色对于隐球菌是特染，荚膜被染呈深蓝色，菌体呈淡蓝色，而周围炎性细胞不着色，因此染色对比清晰，当隐球菌少时也容易观察到。染色玻片能长久保存，褪色后再次复染其隐球菌形态仍完整。[3]
综合以上方法，可将脑脊液细胞学瑞姬氏染色、阿利新兰染色、墨汁染色三种方法联合起来共同检测隐球菌，从而使阳性率大大提高。[3]
隐球菌，陈旧性脑脊液（4℃放置1个月），抗酸染色1000×。菌体肿胀，原本不着色的荚膜，也能着色。
隐球菌
血培养液中，隐球菌的荚膜要比脑脊液中薄很多，但仍然有荚膜，与背景中红细胞形成鲜明对比。
隐球菌
血培养液涂片，见圆形酵母细胞、大小不一、藕断丝连，应该高度怀疑隐球菌的可能。
肺隐球菌病
免疫功能低下患者组织反应轻微或无反应。在这类病例中，酵母菌大量增殖，产生黏液样“囊性”损伤，充满圆形、有荚膜的隐球菌，类似于“肥皂泡”，常见于脑部。[4]
此案例在痰涂片革兰染色镜下发现，追踪并送检病理科确诊。系确诊隐球菌肺炎患者2年后复发，有免疫抑制的基础病史。墨汁染色荚膜薄而不明显，若不重视原始痰标本直接涂片，很可能会漏检。
肺隐球菌病，痰涂片，直接墨汁染色100×。大多数菌体荚膜比较薄。也可见到有宽厚荚膜菌体。
肺是隐球菌最常侵入的部位，而中枢神经系统隐球菌感染临床最常见。[3]
肺隐球菌病发病比较隐匿，痰液墨汁染色或培养阳性率不高，且胸部X线表现多样化，无特异性。胸部CT检查对其有重要诊断价值。[3]
肺隐球菌感染，HE染色。[2] 圆形菌体，有宽厚荚膜，单极出芽。
格特隐球菌S8012菌株，墨汁涂片镜下，呈现针样菌体。[2]
格特隐球菌偶见针形或梭形菌体。[2]
(22)
肺隐球菌病病理图片，黏蛋白卡红染色，670倍。图片来自网络。
黏蛋白卡红染色
主要用于酸性粘液物质和新型隐球菌的染色。
卡红也叫胭脂红，能与媒染剂铝形成复合物，再与粘液内的酸性基团结合而呈红色。新型隐球菌的荚膜属于一种粘液物质，能被卡红染成红色。
黏液胭胆红（Mucicarmine）染色可以给荚膜染色，这有助于区分隐球菌酵母和具有相似特征的其他酵母菌。[1]
组织标本用黏蛋白卡红染色，可见荚膜呈亮卡红色，常呈刺状或圆齿状。[4]
墨汁染色的局限
长期以来，涂片墨汁染色法一直被视为经典的检测隐球菌的方法，该法快速，简单易行，阳性率达54%～74%，常需反复多次送检才能发现阳性结果。[3]
墨汁染色通常被用于检测疑似隐球菌感染的脑脊液、尿液或其他体液样本。通常，这种方法对于痰液或其他细胞数量很多的样本并不适用。[1]
再者，墨汁染色用于观察隐球菌的宽厚荚膜。可是，隐球菌在脑脊液里可以出现典型的宽厚荚膜，但在血培养液、痰液、组织、菌落培养物中荚膜较薄，常不如脑脊液中典型。
“隐球菌细胞的多糖荚膜的厚度变异很大，有的很宽，有的几乎检测不到。围绕细胞的 透明带 取决于菌株本身和使用的培养基。”[1]这时需要联合其他染色方法，来综合判断。
液体标本，联合墨汁染色、瑞姬氏染色、阿利新兰染色，都是不错的选择；组织标本，联合H&E染色、六铵银染色、黏蛋白卡红染色、Fontana-Masson染色（黑色素染色），也可提高检出率。“六铵银染色易检测出组织中的酵母，随后可对组织进行黏蛋白卡红染色，以确定酵母是否含有隐球菌典型的荚膜多糖。当酵母细胞出现不能相互接触时（由于周围包裹黏多糖类荚膜成分），应怀疑有荚膜存在。”[4] “组织中的新型隐球菌酵母细胞通常比念珠菌酵母圆，形态大小差异很大。”[1]
小结
1、脑脊液墨汁染色，仔细检查存在的酵母细胞和出芽的形成是必不可少的。常需反复多次送检才能发现阳性结果。
2、脑脊液中隐球菌的特征：圆形菌体（格特隐球菌可呈梭形），宽厚荚膜，单极出芽，菌体内有反光孢子，菌体大小不一，保持等距离分布。无菌丝或假菌丝，可见“藕断丝连”。
3、检测隐球菌不局限于仅用墨汁染色，建议多种染色方法联合应用，可提高阳性率。将脑脊液细胞学瑞姬氏染色，阿利新兰染色，墨汁染色三种方法联合起来共同检测隐球菌，从而使阳性率大大提高。
4、隐球菌在脑脊液里可以出现典型的宽厚荚膜，但在血培养液、痰液、组织、菌落培养物中荚膜较薄，常不如脑脊液中典型。
5、组织标本，联合H&E染色、六铵银染色、黏蛋白卡红染色、Fontana-Masson染色（黑色素染色），可有效区分隐球菌与其他酵母菌。
6、阿利新兰染色与黏蛋白卡红染色，属于针对荚膜成分的特殊染色，一种用于脑脊液细胞学，一种用于病理组织。