文库构建 之 片段化

写在前面：

本次更新主要介绍文库构建中核酸片段化的常用方法以及不同方法的优缺点。

1.为什么进行片段化？

在实验过程中，我们可能有时候会想为什么要这么做？不这么做行不行？也就是这样做的目的是什么？

文库构建时为什么要对核酸进行片段化？这个主要是由二代测序的原理决定的。二代测序仪测序方式主要分为单端测序（Single-End，SE）和双端测序（Paired-End，PE），不管是PE还是SE，测序读长都是有限的，常见的有PE75bp、SE300bp、PE150bp、SE400bp、PE200bp 等，不同厂家不同类型的测序仪测序读长也各有差异，但我们样本的基因组则是很长、很庞大的，所以只能先将其片段化成一小段一小段进行测序，最后再拼接起来，完成整个基因组的测序。

2.常用的片段化方法

1）机械法片段化

常见的机械法片段化主要是利用超声波打断的方式，将基因组DNA打断成我们需要的片段范围，目前市面上文库构建试剂盒需求的片段化大小为150bp—300bp之间。

然而在实际操作中，不同质量的核酸打断程度则不一样，比如FFPE样本，针对不同的降解程度，需要找到一定的打断条件。

影响超声波打断的因素主要有：

①样本质量：样本质量越好，基因组越完整，所需的超声波强度越强，超声时间相对越久；

②超声波的强度；

③超声时间。

2）酶法片段化

酶法片段化主要是利用一些转座酶或者其他限制性内切酶对基因组进行酶消化，剪切成我们需要的片段范围 。

现在市面上酶切法建库的试剂盒也越来越多，效果也是各有不同。同样针对不同质量的核酸样本也需要调整优化核酸量和酶切时间，从而达到我们满意的酶切片段大小。

影响酶法的因素主要有：

①样本质量：不同降解程度的核酸样本所需的酶切时间不同；

②酶的用量；

③酶切时间。

3）扩增子的方式片段化

在靶位点两端设计引物，很多靶位点的引物组成引物Pool，通过这些引物扩增出我们所需的片段进行测序，主要的有Thermo Fisher的AmpliSeq技术，另外小编也使用过联川生物OmegaPrimer式的引物（当然也是小编用过的最长的和最久的PCR程序），对扩增子法进行靶向富集测序感兴趣的可以下去再详细了解。

3.操作步骤

超声波机械打断的操作步骤可以参考第一期更新的“二代测序之123”。

酶法的操作步骤如下：

4.不同片段化方式的比较：

5.小结

总之，核酸片段化是二代测序过程中不可或缺的一步，选择合适的方法不仅能在实验中节省时间、成本，获得更好的实验结果，使得实验事半功倍，也能解放劳动力。个人觉得，主要看样本类型，如果样本都是质量比较均一的，像gDNA，可以考虑酶法，如果样本质量参差不齐、多样，如FFPE样本，两种方法可以权衡利弊选用。

待续ing

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