编译：胜寒，编辑：小菌菌、江舜尧。
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导读
在西方国家，心血管疾病（CVD）仍然是死亡率较高的疾病之一，因此需要寻找新的靶点治疗心血管疾病。已有研究表明，二型糖尿病（T2DM）病人患有心血管疾病的风险更高。但是传统的CVD危险因素不能充分解释T2DM患者中观察到的风险升高，而且T2DM患者的血糖控制程度也并不能很好地反映CVD的发病风险。所以T2DM可能通过其他代谢途径影响CVD风险。
本文通过非靶向代谢组学分析，发现了一种新的心血管疾病相关的肠道菌群代谢衍生物——苯乙酰谷氨酰胺（PAGln），并揭示了其宿主代谢途径，进一步发现PAGIn可通过G蛋白偶联受体增加血栓形成的潜力。
原名：A Cardiovascular Disease-Linked Gut Microbial Metabolite Acts
via Adrenergic Receptors
译名：心血管疾病(CVD)相关的肠道菌群代谢物通过肾上腺素能受体发挥作用
期刊：Cell
IF：36.216
发表时间：2020.03
通信作者：Stanley L. Hazen
通信作者单位：美国克利夫兰诊所
（1） 采用非靶向代谢组学鉴定出血浆代谢物苯乙酰谷氨酰胺（PAGln），与心血管疾病及其死亡风险上升相关；
（2）采用抗生素处理、体外微生物发酵或无菌动物证明肠道菌群的porA和fldH基因影响宿主的PAGln水平、血小板功能和血栓形成；
（3）探究并验证代谢物的作用以及相关分子机制，发现PAGln通过α2A、α2B和β2-肾上腺素能受体（ADR）引起下游细胞反应，使用抑制ADR的β受体阻断药，可以减少PAGln诱导的高血栓形成风险。
1 非靶向代谢组学鉴定PAGln与CVD相关
在最初的发现队列中，对受试者的血浆进行非靶向代谢组学研究，这些受试者接受择期诊断性心脏评估，3年随访。血浆分析的优先级基于三个筛选入选标准:(1)患主要不良心脏事件(MACE =心肌梗死(MI)、中风或死亡)3年；在监测到的等离子体光谱特征中，与MACE相关的顶级预测分析物被分为两类:一类是分析时已知的结构，另一类是分析时未知的结构。前5名的已知化合物包括三甲胺-N-氧化物(TMAO)和三甲基赖氨酸(TML)，与肠道微生物群代谢和CVD风险相关的化合物，与三种甘油磷脂一起初步鉴定结构。在未知化合物中，MACE相关性最高的候选化合物满足所有三个筛选入选标准(图1A和1B)。等离子体分析物随后通过多种方法被明确地鉴定为PAGln，包括在多个固定相和色谱条件下与真实的合成标准物质显示相同的高分辨率MS/MS光谱和保留时间(图1C）。Kaplan-Meier生存分析显示，PAGln水平高的受试者发生MACE风险更大(3年)(图1D)。具体来说，第四个四分位(Q4)中的PAGln水平与第一个四分位(Q1)中的PAGln水平相比，在糖尿病患者和非糖尿病患者中均显示出显著增加的MACE风险。此外，在对传统心脏风险因素进行调整后，较高的PAGln水平仍然是事件MACE风险的独立预测因子(图1E)。
图1 非靶向代谢组学发现PAGln与CVD有关
2 肠道微生物群在体内参与产生PAGln和苯乙酰甘氨酸
通过检测人体基线水平（Pre-Abx），并且经过7天的口服吸收不良的广谱抗生素鸡尾酒疗法(Abx)，以及三天的恢复期后发现PAGln的产生和肠道微生物相关(图2)。以往对肝提取物或分离酶的研究报道称，人与恒河猴肝酶均可通过苯乙酸(PAA)与谷氨酰胺(Gln)结合形成PAGln，而其他研究表明，PAA可由细菌发酵培养的必需氨基酸Phe产生。除了PAGln, PAA与生成苯乙酰甘氨酸(Gly)的氨基酸甘氨酸(PAGly)结合。因此作者评估了在健康的受试者中Gly和PAA的Gln衍生物的生理分布。相比之下，小鼠的PAGly水平比PAGln高一个数量级(图2B)，经腹腔注射的PAA主要代谢为PAGly(图2C)。常规饲养与无菌(GF)小鼠血清中PAGly水平的比较，或口服Abx暴露前后血清中PAGly水平的比较，表明肠道微生物群是PAA中PAGly形成的关键参与者(图2B和2D)。因此，在人和小鼠体内，PAGln和PAGly都是通过一种代谢途径产生的，其中饮食中的Phe被肠道微生物群转化为PAA，此时，宿主与Gln(人类首选)或Gly(啮齿类首选)发生偶联反应，分别产生PAGln和PAGly。
图2 在人和小鼠体内产生PAGln是一个依赖于微生物群的过程
3 PAGln增强血小板刺激诱导的钙释放和对多种激动剂的反应
在人身上观察到的PAGln水平与血栓之间的正相关关系(图1)提示了PAGln对血小板功能和与血管基质的相互作用的潜在影响。因此，作者使用前面描述的方法，研究了在生理剪切力作用下，PAGln是否影响血小板对胶原蛋白表面的粘附。实验发现，PAGln可影响加速胶原依赖的血小板粘附和扩散的速度(图3A-3C)。进一步发现PAGln影响血小板粘附呈剂量和时间依赖性（图3D）。PAGln还可剂量依赖性地增强血小板对ADP的反应(图3E)以及对糖蛋白ɑ2β3的激活(图3F)。 以上结果提示，PAGln可能直接与血小板相互作用，促进细胞内兴奋性Ca2+浓度升高。为了直接验证这一点，作者从健康供体中提取了分离的人血小板，并加入钙选择性染料Fura 2-AM，观察PAGln对其Ca2+的影响。结果发现单独使用PAGln预孵育对Ca2+水平没有影响（图3G）。然而，生理水平的PAGln剂量依赖性地增强血栓诱发Ca2+水平增加(图3G)。上述数据表明，肠道菌群依赖的代谢产物PAGln和PAGly显著影响血小板功能，增强血小板对胶原基质的粘附，并且PAGln剂量依赖性地增强血栓诱发Ca2+水平增加。
图3 PAGln增强血小板反应性
4 PAGln加速血小板凝块的形成，增强血栓形成的潜力
使用FeCl3诱导的颈动脉损伤模型(一种常用的诱发血栓形成的实验方法)检测了PAGln和PAGly对体内血栓形成的影响。通过静脉注射小鼠的PAGln和PAGly分别显著升高，颈动脉损伤后的血小板凝血率和颈动脉内停止血流的时间均被量化。值得注意的是，与用营养前体Phe或生理盐水(vehicle)处理的小鼠相比(图4B)，PAGln和PAGly均诱导损伤颈动脉内血小板血栓形成增加(图4A)，并相应地减少了损伤后血流停止的时间(即颈动脉血栓形成时间)。
5 肠道微生物基因porA和fldH调节宿主血栓形成的潜力
接下来，作者继续探究宿主体内产生PAGln/PAGly的共生体和基因是否可以调节血小板功能和体内血栓形成的潜力。近年来的研究发现，Phe主要由产孢梭菌（C. sporogenes）代谢为PAA和苯丙酸（PPA），其中参与反应的酶主要由porA或fldH基因编码。因此，作者构建了缺乏功能性porA或fldH基因的产孢梭菌突变株。结果显示，同时携带功能性porA和fldH基因的产孢梭菌只产生了同位素标记的PPA，而不产生PAA。 DcutC、DfldH突变体(仍然拥有功能性porA)不再产生PPA，但却产生了PAA(图4C)。相反，(DcutC,DporA)C突变体(仍具有功能的fldH)不再产生PAA，只形成PPA。然后，作者通过将GF小鼠与(DcutC)C或者与(DcutC,DfldH)C定殖，直接检测了肠道微生物PAA生成对体内宿主血栓形成潜能的影响。从盲肠内容物中提取的DNA经PCR检测，证实了接种产孢梭菌的定殖。根据体外培养数据(图4C)预测，GF小鼠与(DcutC,DfldH)C定殖和与(DcutC)C相比，PAGly水平显著升高(图4 D)。在动脉损伤后，用(DcutC,DfldH)C突变株定殖的小鼠的血栓生成率和损伤血管内血流停止时间均显著降低，并产生较高水平的PAA和PAGly(图4D)。
图4 PAGln和PAGly增强体内血栓形成的潜力
6 PAGln和细胞存在特异性的受体-配体结合相互作用
由于PAGln直接在生理水平上促进细胞效应，作者接下来试图找出可能导致PAGln诱导的细胞事件的潜在分子参与者。为了测试PAGln是否有与细胞受体结合的证据，作者使用了动态质量重分配(DMR)技术，这是一种基于折射率变化的无标签技术，能够实时检测活细胞中依赖于配体的整体细胞反应。接下来作者用MEG01细胞检测潜在结合配体浓度的增加(PAGln vs Norepivs Phe)，显示出饱和和特异性的DMR剂量-响应曲线，这是配体受体与PAGln和Norepi相互作用的典型过程，而不是Phe(图5A)。在平行研究中，在PAGln与人骨髓来源的红血球细胞结合后，也观察到饱和和特异的DMR剂量反应信号。
7 PAGln作用于G蛋白偶联受体引起下游细胞反应
由于PAGln显示了受体-配体与细胞的相互作用特性，作者接下来测试了PAGln诱导的DMR细胞反应是否受到已知的GPCR信号通路调节剂的影响，如百日咳毒素(PTX)、霍乱毒素(CTX)和YM-254890。此外，作者还检测了在没有或存在SCH-202676的情况下，PAGln诱导的DMR细胞反应。SCH-202676是一种广泛的GPCR抑制剂，它可以阻断激动剂和拮抗剂与结构多样的GPCRs结合，这些GPCRs与Gɑi/o、Gɑs和Gɑq蛋白结合。作者使用Norepi作为GPCR结合配体，作为阳性对照，而胶原蛋白(非GPCR结合配体)作为阴性对照。通过将这三种调节因子(PTX、CTX和YM-254890)或使用GPCR抑制剂SCH-202676对细胞进行预处理，可以显著降低MEG01细胞中PAGln诱导的DMR反应(图5B)。此外，使用PTX或CTX预处理细胞，而不使用YM-254890，可以显著抑制PAGln诱导的DMR响应，表明存在Gɑi/o、Gɑs的参与(图5B)。此外，检测对Norepi的DMR反应显示，与每个已知的GPCR单元孵育后，DMR信号显著降低(图5B)。相比之下，使用胶原蛋白的DMR信号(阴性对照)，不受已知GPCR调节剂预处理的影响(图5B)。上述数据表明，在MEG01和HEL92.1.7细胞中，PAGln诱导的DMR反应似乎是通过对一个或多个GPCRs的饱和和特异性反应介导的。因此，作者检测了PAGln是否影响细胞内cAMP或[Ca2]i +的变化。在没有其他激动剂的情况下，单独使用PAGln对MEG0或HEL92.1.7细胞中的[Ca2]i +没有直接影响。但是，在MEG01细胞(图5C)和洗净的人血小板(图5D)中，PAGln确实引起了短暂的(5分钟内)cAMP的适度而显著的升高。此外，使用已知的GPCR调节剂预处理后，CTX或GPCR抑制剂SCH-202676抑制了PAGln诱发的cAMP生成，表明PAGln暴露可触发Gɑs介导的腺苷酸环化酶激活(图5C和图5D)。总的来说，这些数据表明，PAGln通过GPCR(s)介导多个细胞的细胞反应，包括分离的人血小板。
图5 PAGln通过G蛋白偶联受体和ADRs介导细胞反应
8 肠道微生物依赖的代谢产物PAGln通过ADRs起作用
考虑到PAGln通过GPCR(s)介导细胞反应，作者接下来试图确定它们的身份。虽然在人类基因组中存在800多种不同的GPCRs，但作者注意到，PAGln与已知的儿茶酚胺分子结构类似，儿茶酚胺分子与ADRs结合(图5E)。作者最初使用遗传和药理方法对MEG01细胞进行了功能丧失研究。使用以ɑ2A、ɑ2B或β2 ADRs为靶点的siRNA或siRNA转染后，监测PAGln诱导的DMR反应。重要的是，作者证实，当siRNA分别靶向ɑ2A、ɑ2B或β2 ADRs时，MEG01细胞ADR2A, ADR2B, or ADRB2等的mRNA水平分别降低了50%。值得注意的是，针对这三种ADR的每一种siRNA都显示出MEG01细胞中PAGln诱导的DMR响应显著降低，而对照组的siRNA则没有这种效应(图5F)。在补充研究中，作者使用药理学抑制剂来抑制已知的人血小板中的ADR (ɑ2A、ɑ2B或β2 ADRs)，包括选择性β2拮抗剂ICI118,551和非选择性β拮抗剂普萘洛尔和非选择性ɑ2拮抗剂RX821002。上述各抑制剂均显著降低了与MEG01细胞孵育的PAGln诱导的DMR反应，而仅抑制剂不影响DMR反应(图5G)。最后，ICI118551和普萘洛尔(而非RX821002)抑制了PAGln诱导的MEG01细胞中cAMP的产生(图5H)。因此，遗传和药理功能丧失研究均证实，PAGln可通过ɑ2A、ɑ2B或β2 ADRs诱导细胞反应。
9 功能性研究表明PAGln通过ɑ2A、ɑ2B或β2 ADRs引起下游细胞反应
为了进一步证明PAGln通过ɑ2A、ɑ2B或β2 ADRs发挥作用，作者通过在人胚胎肾细胞(HEK293)中分别过表达ɑ2A、ɑ2B或β2 ADRs来进行功能获得性研究，这些细胞因其内源性ADR浓度相对较低而被选择。当用PAGln转染亲代HEK293细胞或空载体(EV)转染HEK293细胞时，均可引起DMR反应，而当用ADRA2A基因(ɑ2A-HEK293)或ADR2B基因(ɑ2B-HEK293)或ADRB2基因(β2-HEK293)转染HEK293细胞时，均可观察到PAGln诱发的DMR反应增强(图6A)。此外，上述选择性ADR药理抑制剂的使用逆转了相应ADR表达细胞中PAGln诱导的DMR反应(即RX821002逆转ɑ2A-HEK293细胞中PAGln诱导的DMR反应，β2-HEK293细胞中PAGln诱导的DMR反应，ICI118551或普萘洛尔均可减弱DMR反应[图6A])。在补充功能获得研究中，作者分析了PAGln对cAMP水平的影响。值得注意的是，亲代HEK293细胞胞内cAMP水平未见PAGln引起的变化(绿线)，而β2-HEK293细胞内cAMP水平显著增加(蓝线)(图6B)。因此，在多种细胞类型中使用遗传或药理方法进行的功能丧失和功能恢复研究均证实，PAGln可通过ɑ2A、ɑ2B或β2 ADRs诱导细胞反应。
10 选择性ADR抑制剂可减轻PAGln引起的血小板反应过度和血栓生成
上述研究表明，ADR阻断剂在CVD中的一些潜在益处可能来自于PAGln诱导的拮抗作用。与此一致的是，作者观察到从低PAGln水平的健康受试者身上恢复的PRP暴露于病理生理学相关水平的PAGln中，增强了ADP刺激的血小板聚集反应。与此同时，在普萘洛尔、ICI118551或RX821002存在的情况下，PAGln会减弱PAGln诱导的血小板过度反应(图6C)。此外，两种ADR抑制剂对ADP刺激的血小板聚集反应均无直接影响(但均可消除PAGln升高导致的血小板聚集反应;图6 C)。因此，每一种ADR抑制剂的加入都会逆转PAGln诱导的血小板过度反应。在最后一系列研究中，作者检验了在临床实践中广泛使用的β受体阻滞剂卡维地洛在体内对PAGln诱导的血栓形成的增强作用。和以前进行的研究一致(图4)，检查了PAGln 对FeCl3诱导的动脉损伤引起的血小板血栓形成率和血管闭塞时间的影响。小鼠有的服用卡维地洛(1.5 g/kg，持续一周)和有的未服用卡维地洛。值得注意的是，在没有β受体阻滞剂治疗的情况下，PAGln再次显著加快了血小板血栓形成的速度(图6D)，缩短了血流停止的时间(图6E)。单独使用卡维地洛对小鼠体内血栓没有影响，用卡维地洛处理逆转PAGln的促血栓作用(图6D和6E)。
图6 PAGln通过ADRs调节血小板功能和体内血栓形成的潜能
结合之前的研究，作者认为利用非靶向代谢组学作为平台，结合功能研究，可以作为一种相对公正的方法来揭示可能导致心血管疾病及其不良并发症的新的代谢途径。作者最初选择将研究集中在已知的CVD风险升高的易受伤害的糖尿病群体。研究发现，T2DM患者CVD风险升高的部分机制与传统的CVD风险因素和血糖控制程度不同。因此，作者试图找出T2DM患者与CVD的发展相关的循环代谢物。值得注意的是，许多符合这些标准的候选者被证明与肠道微生物群有机械联系。此外，在T2DM患者和非糖尿病患者中，均观察到PAGln(与TMAO和TML相似)与CVD风险的发生率相关。此外，相当比例的代谢候选物和代谢途径与肠道微生物有关，肠道微生物是最大的环境暴露过滤器.
如图7所示，总结了PAGln的起源、ADRs对其的识别及其与CVD的总体关系。摄入Phe后，大部分必需氨基酸在小肠内被吸收，但未被吸收的到达大肠的Phe可被肠道菌群代谢，形成苯丙酮酸(最初由微生物群产生的脱氨产物)和PAA。在进入门脉系统后，PAA在肝脏中易于代谢，产生PAGln(人类的主要产物)和PAGly(小鼠的主要产物)。PAGln被人类肝脏和肾脏组织认为是PAA和Gln的合成产物。目前的研究证实了人与小鼠体内的PAGln(和PAGly)生成中肠道微生物群的主要作用，正如用抗生素鸡尾酒抑制肠道微生物群的研究和用GF与常规饲养的小鼠对比的确证研究所显示的那样。值得注意的是，近期有限数量的研究表明，使用半定量分析，PAGln与某些心脏代谢表型之间存在关联。例如，在一项研究中发现，PAGln水平在终末期肾病患者(某些患者超过500毫米)中显著升高，并与死亡率相关。然而，在另一项关于终末期肾病的研究中，虽然有报道称肾病患者的PAGln明显升高，但未观察到PAGln与死亡率之间的关系。最近研究发现，尿中PAGln水平升高也与肥胖、早期肾功能下降和糖尿病有关。尽管有这些报道，PAGln和CVD发病机制之间的联系尚未被报道。
目前的研究表明，PAGln升高与CVD风险事件之间的临床联系可能通过几种机制发生。
（1）首先，PAGln被证明可以通过多种互补的方法影响血栓形成的可能性。使用全血、PRPs和分离血小板的体外细胞研究均表明，PAGln(和PAGly)可增强血小板功能(增强对多种激动剂的刺激依赖性反应和细胞内钙释放)。
（2）此外，大量的体内研究表明，在动脉损伤模型中，病理生理相关水平的PAGln或PAGly均可促进血栓形成率的提高和血栓形成的潜力。值得注意的是，小鼠的菌群移植研究表明，肠道微生物fldH基因和porA基因可以调节PAA和PPA的肠道微生物产量，从而影响宿主体内的PAGly产量。至关重要的是，FldH和PorA蛋白之间的活性平衡最终影响了在生源条件下定殖的小鼠体内血栓形成的可能性，这是通过动脉损伤后血栓形成率和血管闭塞时间来监测的。
另一个PAGln可能影响CVD相关表型的机制是通过其与GPCRs的相互作用，包括ADRs。直接的生物物理研究表明，PAGln与细胞的饱和和特异性结合，表明了细胞受体与配体的相互作用。一系列系统的基因功能丧失和功能增加的研究，以及多种确证性药理学抑制剂和激动剂研究明确表明，PAGln可以通过已知在血小板上表达的ɑ2A、ɑ2B或β2 ADRs传递信号。此外，在小鼠动脉损伤模型中，PAGln诱导的促血栓形成作用在临床实践中被广泛使用的β受体阻滞剂逆转。
此外，使用特异性ADR siRNA敲除或ADR拮抗剂的研究均显示可阻断PAGln诱导的促血栓形成表型，进一步表明PAGln可通过ADRs促进细胞信号。众所周知，β受体阻滞剂治疗对某些CVD患者有诸多临床益处(例如，降低心脏病发作、中风、心力衰竭和死亡的风险)。目前的结果表明，β受体阻滞剂治疗的一些临床益处可能部分是通过在体内减弱PAGln触发的ADR信号反应来实现的。值得注意的是，卡维地洛已被证明促进抑制血小板功能。肾上腺素能系统的激活对新陈代谢也有深远的影响，长时间的激活会导致胰岛素抵抗，葡萄糖和脂肪酸代谢的改变，以及线粒体功能障碍。虽然目前的研究目前只关注在人类血小板中表达的三种ADR，但可以推测，PAGln有调节其他ADR的潜力，因此可能潜在地影响体内多个ADR相关的生理过程。
图7 肠道微生物代谢产物PAGln参与通过ADRs增强血小板血栓形成
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