综述│TRENDS BIOTECHNOL：空间转录组揭示单细胞分辨率下的器官分子结构（国人佳作）
编译：微科盟刘娟，编辑：微科盟景行、江舜尧。
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生物学和药理学研究的基础是揭示空间尺度的细胞异质性、组织功能和结构。与传统单分子或大数据组学方法不同，尖端的空间转录组学技术可以解析组织内单细胞甚至亚细胞。跨维度的海量信息以及位置协调有助于更好地绘制整个组织3D转录图。这篇综述重点介绍空间转录组的发展和方法，详细比较现有的细胞、基因通量和空间解析方法，强调其在生物医学研究中的巨大潜力。
论文ID
原名：Uncovering an Organ’s Molecular Architecture at Single-Cell Resolution by Spatially Resolved Transcriptomics
译名：空间转录组学揭示单细胞分辨率下的器官分子结构
期刊：Trends in Biotechnology
IF：14.343
发表时间：2021年1月
通讯作者：范晓辉
通讯作者单位：浙江大学
DOI号：10.1016/j.tibtech.2020.05.006
研究进展
1 空间异质性是器官功能的重要特征
人体组织是一个高度复杂的系统，由多达数万亿个细胞组成，这些细胞在种类、时间和空间上各不相同，但相互协调，形成独特的微环境，以维持器官功能和处理信息。人体器官分子基础研究从初级到深层次都有涉及，通过这一广泛的过程，人们逐渐达成科学共识，即无数具有不同功能类型的细胞数量，加上发育(时间)和区域(空间)差异，构成哺乳动物器官转录异质性的主要组成部分。高通量单细胞RNA测序(single-cell RNA sequencing,scRNA-seq)的新兴前沿技术在推断细胞类型和轨迹方面取得相当大的成功，特别是将scRNA-seq方法应用在发育生物学问题。伪时间分析、标记细胞起源的内源性条形码等方法是在一定时间间隔连续取样以揭示细胞命运、细胞谱系和发展轨迹，这些信息一旦在悬浮状态下解离，就需要进行基于流动细胞的scRNA-seq，如inDrop、Drop-seq、Microwell-seq和SPLiT-seq。
大脑是哺乳动物最重要但最复杂的器官，其空间异质性至关重要，不同脑区的组织具有不同的功能和细胞类型。在大体水平上，早期研究通过主要生物学标记物的组织学染色揭示致病因素。最近，在DNA测序、基因芯片和基于下一代测序(NGS)的RNA-seq技术的支持下，不同脑区组织的基因组学、转录组学和蛋白质组学等高维组学数据被用来更好地表征中枢神经系统架构的分子景观。然而，批量检测可能掩盖特定细胞类型中显著基因的表达，阻碍进一步的研究趋向于高辨率可接受的、结合转录本衍生位置信息的更全面脑图谱方向发展，它将有望揭示复杂器官内部的空间异质性。因此，空间转录组学一直是研究人员的长期目标，从早期尝试使用基于荧光原位杂交(fluorescence in situ hybridization,FISH)的方法到目前单细胞分辨率的空间转录组检测。最近，有研究者利用他们较早提出的RNA成像方法——多重抗误差矫正荧光原位杂交技术(MERFISH)呈现下丘脑视前区的空间分辨图谱，根据其研究结果，下丘脑视前区大约有70簇神经元，远小于整个大脑。同一群体内的细胞在空间分子特征相互区别，为了更好地理解细胞，需要同时记录它们的转录异质性和空间坐标。
本综述深入讨论最常用的空间分辨转录组学分析方法、技术及其在基础和生化研究中的巨大应用潜力。
2 空间分辨转录组学技术的发展
现有的空间分辨转录组学方法主要分为四类：空间重构的计算机方法与组学实验相结合、激光捕获显微切割(laser capture microdissection,LCM)与NGS相结合的直接测量、基于荧光物质的图像原位转录组学以及基于寡核苷酸的空间条形码与NGS相结合的空间转录组学。每种方法各有优缺点。不同解码空间异质性方法的基因(即检测到多少个基因物种)和细胞(即分析一次有多少个细胞)通量总结如图1和表1所示。
图 1. 每种空间分辨转录组方法的基因和细胞通量。方法按照其类别，以不同的形状、符号和大小呈现(菱形：用于空间重构的电子方法，紫色圆：空间标注方法，橙色圆：基于LCM的方法，橙色圆：MAPseq，蓝色圆：基于图像的目标方法，蓝色圆：基于图像的非目标方法)。不同符号代表每种方法的空间分辨率(橙色细胞：细胞分辨率，蓝色细胞：亚细胞分辨率，多细胞：区域分辨率)。每个符号的大小大致与其空间分辨率有关。x轴和y轴分别表示每柄被测细胞或点的数目和他们实验中确定的实际基因。简称：ExFISH：扩展FISH、FISH：荧光原位杂交、FISSEQ：荧光原位测序、GEO-seq：空间位置测序、HDST：高清空间转录组学、ISS：原位测序、LCM：激光捕获显微切割、MERFISH：多重抗误差矫正荧光原位杂交技术FISH、MAPseq：基于测序技术的多重分析，osmFISH：ouroboros单分子FISH，PLISH：邻近连接原位杂交，secFISH，序列FISH，smHCR：单分子杂交链式反应，SRM：超分辨显微镜，STARmap：空间分辨转录放大读出图，TIVA：体内转录组分析、TSCS：空间单细胞测序。
表1 .详细比较目前空间分辨转录组学的方法和技术。
2.1 空间重构的计算机方法
由于流式细胞scRNA-seq过程中细胞空间信息丢失，RNA染色方法只检测到部分转录本，因此整合多尺度数据，将电子技术应用于组织的空间转录组重建是必要的。例如，Satija和同事开发Seurat(图2A)，这是一个广泛分布的R包，可以通过结合scRNA-seq数据和标记基因的原位杂交来推断细胞定位。具体来说，SMART-seq对发育中的斑马鱼胚胎851个个体细胞的单细胞基因表达进行分析，将细胞分为不同类型，并为每个细胞类型产生标记基因。标记基因FISH实验显示它们表达模式的空间分布，产生标记基因在整个组织的表达密度。最后，根据标记基因的表达谱和表达密度可以定位单个细胞。最近，该小组发布Seurat的第三个版本，用于跨数据集的单细胞信息的综合集成。同样，Achim和同事提出一种方法，通过比较scRNA-seq数据和基因表达图谱中的位置基因表达来定位单个细胞的起源。Durruthy和同事利用单细胞基因表达数据建立中空球形组织三维重建的标准操作步骤，该方法根据单个细胞的相关性来识别其空间相关性，先前研究中定义良好的靶向基因对于根据表达域将球体划分为推测轴(背侧/腹侧、远端/近端)的参考数据至关重要。表达靶向基因的细胞首先被分配回靶点，其他则根据它们与靶点之间的距离，利用非线性主成分分析(PCA)等非线性降维算法将其映射到三维空间。这种计算机方法充分利用固有的基因表达模式或共表达趋势，提供从单细胞的巨大转录组学数据中获取细胞与细胞相互作用的信息，但这些演绎法在某些情况下受到限制，只呈现空间趋势或特定组织的总体布局。因此，有必要精确描述组织中实际的单细胞转录组织，开展更深入的分析。
2.2 基于LCM的方法
另一种获取精确位置信息的转录组的方法是利用LCM从组织切片中单独分离单细胞或整个感兴趣区域。LCM是一种在显微镜引导下的强大切割系统，以紫外光作为接触和无污染的刀，感兴趣的细胞被切割并收集在不同的容器中，以尽量减少空间信息损失。随后，细胞可以通过直接的RNA-seq或预先标记空间条形码的多重过程进行分析。Moor和同事利用LCM和bulk RNA-seq在空间上分析肠绒毛片段，然后在平行scRNA-seq实验中根据共同表达的标志性基因将单个肠细胞定位到其推测的原始位置。LCM能在微米分辨率下精确地从组织中分离出感兴趣的区域，其应用更多集中在单细胞分离。
LCM-seq(图2B)设计用于为基于LCM的直接scRNA-seq设置标准。例如，LCM结合Smart-seq2可对小鼠运动神经元和人尸检组织进行精确的空间转录组学分析。研究表明，scRNA-seq是可行的，LCM-seq的成功率为62%。另一个研究小组提出地理位置测序(geographical position sequencing,Geo-seq)技术，该技术通过利用已知的关键基因列表(zip-code genes)将细胞定位回原点(图2B )，保留原点空间位置的同时，对少量细胞的转录组进行分析。
此外，Casasent和同事开发一种基于LCM的方法，称为地形单细胞测序(TSCS)，用于比较乳腺导管原位癌(DCIS)区和浸润性导管癌(IDC)区细胞的基因组差异。将组织切片置于载玻片上，进行苏木素-伊红(H&E)染色，显微镜下辨认出单个细胞核(图2B)。然后使用LCM系统从组织切片中捕获单个细胞，同时记录每一组坐标。接下来，将细胞分离成预条形编码的缓冲液，进行裂解和全基因组扩增(WGA)。最后，所有cDNA经多重NGS后汇合。总体而言，LCM分离出1293个单细胞，随后通过单核测序(SNS)开展轮廓分析。
尽管通量很低，基于LCM的转录组学或基因组学成功实现单细胞的空间转录组。多重条形码策略能够标记数十万个单个细胞的确切位置，将可计数的细胞数据粗略地整合到器官中，就像将液滴注入海洋一样。
2.3 基于图像的原位转录组
基于图像的原位转录组解决了细胞通量的问题。最初的方法称为单分子FISH (single molecule FISH，smFISH)，能够检测单个转录本，被设计用于同时检测一个到几个(典型的3或4个) mRNA的亚细胞分辨率FISH。随后，研究者尝试用多重smFISH来增加每个细胞位点的可检测mRNA的种类。扩展FISH(Expansion FISH,ExFISH )被用于数十个培养细胞中探索7个靶基因，而邻近连接原位杂交(PLISH)可测固定组织中8个基因。亚序列的ouroboros单分子FISH(ouroboros singe-molecule FISH,osmFISH )能够同时测定来自组织切片的成千上万个细胞的33个基因。序贯FISH(Sequential FISH,seqFISH )可以通过多轮杂交对单细胞内转录本进行条码化的方法。如框1所示，在这项技术的发展过程中，检测能力从固定细胞中的12个基因增加到组织切片中的10000多个基因。
同样，被称为MERFISH的候选方法可以显著增加每个单细胞可测数至多1000个mRNA (图2C)。MERFISH包含一个框架，将每个RNA物种在原位转化为独特的N-bit。通过靶向RNA物种的一个子集，如果观测点上存在荧光点，则可将一个输出检索为1，否则检索为0。经过N轮杂交后理论上产生2N-1RNA物种。但随着N的增加，检测错误率逐渐增加，可检测的mRNA种类逐渐减少到1000种。对N-bit进行解码，可以将相应的mRNA物种注释到其空间起源上。值得注意的是，近年来，MERFISH在分析100多万个细胞和针对10 000个mRNA物种两个方向得到广泛的证实。
框1.seqFISH的基本理论和示意图。seqFISH是一种不断发展的方法，可以直接利用多重smFISH原位识别和定量RNA转录本，克服smFISH中荧光染料的局限性。seqFISH通过序列的smFISH将mRNA物种的条形码化，从而指数地提高区分能力。如图I所示，在每一轮中，目标转录本通过一组标记有单一颜色的FISH探针杂交。在相邻的一轮中，转录本与相同的探针杂交，但与另一颜色杂交。条形码的生成数量以指数形式表示为FN，其中F为颜色数，N捐赠杂交轮数。随着时间的推移，随着可用颜色和杂交轮数的增加，可以测量的基因数量从几十个增加到几百个增加到几万个。同时，检测靶点也从mRNAs扩展到lncRNAs。例如，RNA SPOTs从小鼠成纤维细胞和胚胎干细胞中检测到10212个mRNA，内含子seqFISH可以在其起始转录活性位点成像10421个基因，而seqFISH+在小鼠脑组织中检测到10000个mRNA，准确率较高。
图I.seqFISH和细胞成像示意图。在每一轮smFISH中，每个转录本与一组已知颜色荧光标记的探针杂交，成像记录其位置和颜色，然后经DNaseⅠ处理去除。在接下来的一轮中，相同的探针被重新杂交到转录本上，但耦合到不同的荧光团。由于转录本是固定的，在几轮杂交过程中保持不变的点可以标记为exclusive转录本。通过对时间颜色序列的解码，可以识别出原始基因。与smFISH相比，smHCR和seqFISH的结合提高20倍的信噪比。简称：seqFISH，序贯荧光原位杂交，smFISH，单分子荧光原位杂交，smHCR，单分子杂交链式反应。
空间分辨转录放大读出映射(STARmap)是直接针对1000多个基因的互补方法。与其他基于图像的方法类似，水凝胶-组织化学被用来使组织内部的每个细胞成为可观察RNA成像的理想容器(图2C)。锁链系统设计是分子内连接(SNAIL)特异性扩增核酸，包括一对引物和锁链探针。值得注意的是，只有当两个引物对同一mRNA进行配对时，才可以启动锁探针进行滚动循环扩增，并生成一个称为扩增子的DNA纳米球。
每个探针都包含一个5碱基的条形码(文库大小：1024)，作为基因特异性识别物。与传统的只编码单碱基的方法相比，为降低单碱基读出的错误率，本研究提出一种基于动态退火和连接减少错误率的测序方法(SEDAL)。经过六轮读出，每个条码都可以解码并注释到特定的mRNA物种。该方法评空间细胞类型分布，获得了完整组织的三维视图。相比之下，与STARmap(框2)原理相似的早期方法有两种，分别称为原位测序(in situ sequencing,ISS)和荧光原位测序(fluorescence in situ sequencing，FISSEQ)。ISS是一种比STARmap更低的目标数量和检测精度的靶向方法。FISSEQ通过阅读每个转录本的27个碱基，在培养的成纤维细胞中无偏倚检测超过8000个RNA种。但由于难以在原位生成长读数，它未能应用于组织切片。最近，Fürth和同事提出一种新的方法—原位转录组可及性测序(in situ transcriptome accessibility sequencing,INSTA-seq)，允许无偏倚探索目前基于杂交的方法无法区分的小的调控变体或受短读限制的原位测序。基于图像的原位转录组在相当程度上增加了检测区域，但也提出一些挑战性的问题，例如，几种smFISH方法可以在整个组织中提供定量的mRNA成像，但单细胞很难从复杂的背景中提取，如信号干扰、转录本积累和细胞排列拥挤。此外，与RNA-seq相比，这些靶向方法具有更高的错误率和对预选基因的要求的局限性。使用一组探针作为诱饵获取给定RNA物种的全部信息时，容易出现错误，与RNA-seq的另一个主要区别是，靶向方法没有检测到新的序列或小的序列变异。
框2.ISS和FISSEQ的基本理论和图式。ISS的靶向方法可以在固定的细胞或组织中分析靶向基因。mRNA最初被原位反转录成cDNA。与STARmap类似，cDNA随后与条形码锁探针连接，通过连接循环，通过目标引物滚动循环扩增(RCA)扩增。将得到的微米分辨率的滚动循环产品(RCPs)经过多次成像循环后读出条形码进行测序(图I，顶部 )。相比之下，FISSEQ理论上提供对单个细胞内整个转录组的无偏倚测量，而不是针对特定基因。RNA在固定的细胞中用随机六聚体在5′端带有一个标签(cyan)进行反转录。将制备好的cDNA在RCA前循环，然后用交联剂[BS(PEG)9]将其交联到细胞-蛋白基质固定化。RCPs通过SOLiD测序，读取长度为30个碱基(图I，底部)。最近，新一代FISSEQ（INSTA-seq）已经启动，随着使用NGS组装的阅读框更长，FISSEQ 2(INSTA-seq)检测到以前因短读限制而未解决的小调控变体。
图I.两种ISS方法的示意图。(顶部)cDNA经靶引物RCA循环扩增，形成DNA纳米球。通过连接化学方法对RCPs进行测序，以解码锁探针内的4基条码。(底部)用[BS(PEG)9]交联细胞蛋白质基质，固定由多个cDNA序列串联重复组成的RCA产物，用SOLiD (寡核苷酸连接和检测测序)对短读片段进行无偏测序。缩写：ISS，原位测序，RCA，滚动循环扩增。
2.4 空间编码（Spatial Barcoding）及NGS
利用探针代表RNA物种的靶向原位方法存在不足，越来越多的研究聚焦在相对较小的尺度上直接原位测序或组织切片空间标记。空间转录组学(Spatial transcriptomics,ST)(图2D)就是其中一种方法,开发带有分散的100μm微孔的定制载玻片来捕获mRNA。每个孔涂上包含空间条形码的寡核苷酸，这是对应孔的专属空间条形码和poly T尾巴，以捕获带有poly A的mRNA。在一个6毫米×6毫米的正方形中，总共产生1007个条形码微孔。微孔内的寡核苷酸可以捕获透化组织切片中的mRNA。cDNA合成在载玻片上进行。随后，使用基于NGS的RNA-seq生成转录组，通过将空间条形码映射回每个微孔，最终解码位置信息。最近开发的高分辨率空间转录组学(high-definition spatial transcriptomics,HDST)使用分裂池方法生产高分辨率(2μm)，高密度(百万)珠阵列。与ST相比，HDST显著提高空间分辨率。然而，HDST平均每个池有7个独特的分子标识符(unique molecular identifier,UMIs)，严重限制其测量高丰度基因的能力。
随后开发的Slide-seq给高通量实验提供足够的空间特征。在Slide-seq(图2D)中，首先将一层10μm独特条形码的微粒(珠子)包裹在橡胶涂层玻璃覆盖面上。与其他高通量scRNA-seq方法中使用的微珠类似，每个微珠上的条形码是随机分布的。因此，在对每个珠状物进行条形码寡核苷酸鉴定之前，必须先将它们放在一起进行测序。为解决这一问题，Slide-seq利用寡核苷酸连接和检测(sequencing oligonucleotide ligation and detection,SOLiD)化学的测序方法，随后获得每个珠上不同的条形码。在RNA-seq之前，在每个10μm点上解析唯一的空间标识符，寡核苷酸捕获的mRNA的表达可以映射回其原始的空间坐标。因此，Slide-seq以堪比单个细胞大小的分辨率对150万个点进行测序，但Slide-seq与Drop-seq相比，每个珠子的UMIs更少。
当转录水平和空间位置有一一对应关系时，空间条形码和NGS构成定位巨大单点的直观概念。为此，要么可以合成足够的独特的已知条形码，并将其特定地处理到指定的点上，要么必须进行额外的测序程序来定位每个条形码珠。然而，这两种方法价格都昂贵且都不能在单个细胞中获得转录组。
图2.四种空间分辨转录组学的模式图。（A)空间重构的计算机方法。以Seurat为例，斑马鱼胚胎膜首先分离并消化成离散的单细胞。后续scRNA-seq用于确定每个细胞类型的基因标记。采用原位杂交技术对各标记基因的表达分布进行分析。最后，单个细胞可以被定位膜上特定的"仓"内。(B)基于LCM的方法。冰冻组织切成10μm切片，染色后用特定颜色标记单个细胞。划线细胞由LCM分离，然后在单独的管子(LCM-seq和GEO-seq )或96孔板( TSCS，装载有良好的条形码)中裂解。最终，每个细胞内的转录本都可以被测序。(C)原位RNA成像方法。探针在切片的冻存组织中转移到每个细胞中。对于MERFISH，N轮荧光读出可以对每个mRNA进行二进制编码，通过解码可以确定mRNA的种类。对于STARmap，6个循环的荧光读出可以解码条码序列，然后定位与信号放大探针杂交的mRNA。(D)原位测序方法。mRNA被预加载的条形码原位捕获，这些条形码代表空间位置。测序完成后，通过对条码序列的解析，映射出原始地址。简称：GEO-seq：地理位置测序、LCM：激光捕获显微切割、MERFISH：多重抗误差矫正荧光原位杂交技术、scRNA-seq：单细胞RNA测序、SOLiD：寡核苷酸连接检测测序、ST：空间转录组学、STARmap：空间分辨转录放大读出图谱、TSCS：空间单细胞测序、UMI：唯一分子标识符。
3 前沿空间转录组学技术的应用
目前空间解析转录组学技术不完善，但组织分子结构已经可以用于临床和生物学研究(图3)。
图3.空间分辨转录组学的应用。空间分辨转录组学可以解决以下三个主要问题：左，发现疾病的空间异质性；中，建立人体空间转录组图谱；右，描绘胚胎发育和空间蓝图。
3.1 发现疾病的空间异质性
许多生物过程中基因表达呈现空间模式,很难通过传统的批量基因分析或经典scRNA-seq发现这些模式。在疾病的发生发展过程中，空间异质性具有根本的重要性，了解细胞类型及其在病变组织中的定位有助于解析空间转录组。在不同的环境下选择不同方法在生物研究中至关重要。在神经科学中，以鱼类为基础的研究方法盛行的原因如下:第一，许多细胞群的特征可以由几个标记而不是整个转录组来表征;其次，基于FISH的方法可以以亚细胞分辨率提供给定标志的景观视图;第三，图像处理是分析和可视化领域中较为普遍和成熟的技术。例如，scRNA-seq在小鼠阿尔茨海默病(AD)模型中发现一种新的小胶质细胞类型与神经退行性疾病相关。为定位这些小胶质细胞，作者发现标记物并使用smFISH“减轻”它们。在他们的研究中，这些被激活的小胶质细胞被特异性地定位在AD斑块附近，这表明这种细胞类型可能与AD的起源密切相关，并为开发小胶质细胞激活药物作为靶向治疗策略提供机会。此外，在与大量表型改变相关的疾病中，如癌症，不同细胞中的基因表达可能有显著差异，以适应各自的微环境。例如，Little和他的同事在病理标本中使用详细的多色FISH绘图程序，发现在胶质母细胞瘤中癌细胞在几乎没有血管的区域,特别是，这些细胞显示出扩增的表皮生长因子受体转录本，而具有血小板来源的生长因子受体基因扩增的癌细胞富集在内皮细胞附近。相比之下，以LCM为依据的方法适合小样本(如临床样本)和全转录组或基因组分析，因为它的细胞通量低，但全基因覆盖和无偏倚细胞分离。将上述TSCS方法应用于乳腺癌研究，追踪克隆侵袭模式和疾病进展过程中发生的基因组进化。他们的研究结果表明，大多数突变和拷贝数变异在侵袭之前在导管内进化，形成一个多克隆侵袭模型，在该模型中，重要的克隆逃离导管并迁移到邻近组织中，从而建立侵袭性癌。
3.2 建立空间转录组图谱
单细胞转录组图谱有助于在分子水平上研究生物结构。美国国立卫生研究院(NIH)将在未来7年内投入大量精力开发一个前所未有的人类生物分子图谱。美国国立卫生研究院共同基金人类生物分子图谱计划(HuBMAP)旨在通过支持技术开发、数据采集和详细空间绘图，建立一个全球可访问的框架在单细胞分辨率下全面绘制人体细胞图谱。在老鼠身上,除了用MERFISH从小鼠脑中110万个下丘脑视前区的细胞中发现的转录组景观外,Deisseroth和同事扩展他们的STARmap方法，在3万多个细胞中通过6层完整的小鼠初级视皮层描绘出23个细胞类型标记，以进一步研究完整3D大脑的复杂性。
Zeisel和他的同事将scRNA-seq和FISH结合，揭示小鼠神经系统的分子结构。他们描绘大脑各区域的细胞，并提供各区域的基因表达图谱和进一步研究的参考图谱。Asp和他的同事使用ST来描述人类心脏的时空基因表达模式，为发育中的人类心脏建立跨越时空的细胞图谱。只有通过这样的共同努力，增加细胞和基因通量，同时保持细胞的空间环境，才有可能建立一个完整的空间转录组图谱的生物结构。当不严格限制于单细胞时，Slide-seq是一个几乎完美的选择，因为它在细胞通量和基因覆盖方面都有出色的表现。
3.3 描绘胚胎发育和空间蓝图
胚胎发育是在生物分子水平上发生快速动态变化的复杂过程，对这种微小变化的时间和空间方面的分析一直具有挑战性。空间转录组学技术有望解析胚胎发育的空间表达蓝图。在黑腹果蝇杂交胚胎发育过程中，基因调控表现出空间差异，转录组分析技术发现不同空间调控的基因，即84和39个具有D.melanogaster和D.simulan-biased等位基因特异性表达的基因。此外，单细胞内固有的基因调控网络可以与空间环境相互作用来定义细胞的特性。例如，朱和同事开发出一种方法，能够根据整体基因表达来区分小鼠视觉皮层区域的细胞类型和空间域相关的异质性，根据这种方法，在谷氨酸和星形胶质细胞的细胞室中发现明显空间相关的、细胞类型独立的特征。Shinozaki和他的同事利用LCM和手部解剖结合RNA-seq分析，发现不同番茄区域和不同成熟梯度的基因表达模式的空间差异。彭和同事通过整合空间和时间信息，研究早期小鼠胚胎谱系分配和组织组织的分子结构，在早期小鼠胚胎发生过程中揭示关键调控网络。
结论和展望
空间转录组在发现疾病因素、建立空间图谱和描绘空间蓝图等方面得到广泛的应用和推广，但其潜力远远不止于此。例如，在细胞间相互作用的研究中，从转录组数据和已知的配体-受体复合物推断不同细胞类型相互作用，但单细胞间持续的相互作用很难立即捕获。无论是在组织中还是在培养环境中，封闭空间内的细胞更容易发生相互作用，这正是空间转录组的应用所在，因此有望将其引用到细胞间相互作用的研究中。一些巧妙的实验表明，缺血神经元的体细胞和轴突线粒体在单细胞尺度上是相通的。此外，scRNA-seq技术多方面促进空间转录组的发展，例如从细胞分型中提供标记基因，有助于scRNA-seq通过基因的空间分布来区分亚群。基于图像的方法如seqFISH+、MERFISH和STARmap提供观察单个细胞内分子行为的亚细胞视图，因此，分析基因-基因交互作用组、基因调控网络和多模态组学是可行的。研究表明，DNA变异与mRNA表达有关，因此，同时检测分子的原始坐标可以加深对转录因子如何激活基因表达、基因如何相互沟通以及细胞如何功能的理解，未来前进的方向是突破这些突出问题的瓶颈。
其中的主要问题是原位获取单细胞的无偏倚转录组，因为大多数现有的基于实验的方法都来源于靶向方法smFISH。SMR、单分子杂交链式反应(single-molecule hybridization chain reaction,smHCR)和osmFISH具有优异的检测效率和信噪比，但都受到目标数的限制。相比之下，seqFISH+和MERFISH可以原位测量来自众多细胞的10000多个mRNA，但它们不能提供新序列或小序列变异的无偏倚检测。FISSEQ在有针对性和无偏倚的方法之间起到折中的作用，但这种方法效率低，难以在组织上开展。此外，仅对短读进行排序并不足以准确检测变体或新片段。基于LCM的方法一旦突破细胞通量低的瓶颈，具有巨大的潜力，因为它们可以通过深度测序获得全基因转录组。克服这一瓶颈包括3个方向：细胞边缘识别和裂解、分离细胞的多重条形码重新定位和提高显微切割效率。HDST和Slide-seq获得区域分辨率为微米量级的无偏倚转录组和位置信息。因此，需要开发与高通量scRNA-seq相符合的高空间分辨率新技术以解决一系列生物学问题。
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