编译：Carota，编辑：十九、江舜尧。
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免疫检查点抑制剂（PD1/PDL1抑制剂）在癌症治疗中取得了显著的临床成功，但其作用机制尚不清楚。由于缺乏癌症患者个体克隆型T细胞分布的定量信息限制了对T细胞在肿瘤免疫中的起源和命运的认识。在这篇文章中，作者对不同类型癌症患者的RNA和T细胞受体（TCR）进行了深度单细胞测序，探讨不同肿瘤、邻近正常组织和外周血中T细胞亚群和T细胞受体的概况。研究发现效应样T细胞不仅在肿瘤内克隆扩增，而且在正常的邻近组织也发生了克隆扩增， 而且具有这种克隆型扩增特征的患者对PDL-1抑制剂治疗反应最好。值得注意的是，在外周血中也可以检测到这种在肿瘤和邻近正常组织中发现的扩增克隆，因此为疗效敏感患者的识别检测提供了一种更加简便的方法。作者继续联合分析了自己的数据集以及几个外部的数据集发现：在治疗反应较好的患者中，瘤内T细胞由来自瘤外T细胞源源不断的替代补充。提示这些治疗有反应的患者肿瘤免疫呈持续激活状态，并且其加速反应可能与临床反应有关。
原名：Peripheral T cell expansion predicts tumour infiltration and clinical response
译名：外周T细胞扩增可预测肿瘤浸润和临床反应
期刊：Nature
IF：43.07
发表时间：2020.02.26
通讯作者： Jane L. Grogan
通讯作者单位：美国加州南旧金山基因技术公司(Genentech)
DOI号：https://doi.org/10.1038/s41586-020-2056-8
作者对14名来自四种不同类型癌症初治患者的141,623个T细胞中的3.3亿个mRNA转录本进行了测序。每个患者的样本来自于手术切除的肿瘤组织、邻近的正常组织(NAT)和其中4个患者外周血样本。利用单细胞T细胞受体（scTCR-seq）技术测序，进而通过匹配CDR3区域将T细胞归类为56975种不同的克隆类型，以便于测量组织中T细胞的克隆扩增以及追踪克隆谱系。研究发现患者之间共同的克隆型很少，但是许多克隆型同时存在于肿瘤和相对应的NAT中。代表T细胞多样性的单一克隆较多，但是每个患者的9%-18%的克隆型是多扩增克隆或者双重扩增克隆，并且双重扩增的克隆型在观察到的细胞中占很大一部分。进而对NAT和肿瘤样品中进行细胞计数来分析克隆，发现患者之间的克隆存在很大异质性。在某些患者中，双克隆扩增沿对角线排列，说明两个区室中的细胞计数大致相等，表示肿瘤和NAT中平行和协调的克隆扩增过程。而在其他患者中，双克隆散落不在对角线排列表明每个克隆在肿瘤和NAT中是独立的，二者分别具有不同的浸润和迁移模式。作者假设：肿瘤和NAT中克隆的平行扩增可能代表了T细胞从外围、渗出液和炎性血管的渗透浸入。作者因此从匹配的血样中获得了支持的证据，在外周血中高度扩增的克隆也可以在肿瘤内和NAT中找到平行扩增的证据（1a）。为了量化观察到的结果，作者不仅根据组织中克隆的扩增程度，还根据外周血中克隆的大小来对克隆进行分类(1b)。在血液中有单个或多个组成细胞的克隆分别被称为血液不扩增和血液扩增，而在血液中没有任何相关细胞的克隆被称为血液无关。通过这种模式,作者将血液T细胞的比例作为一个对所有克隆外周扩增的测量方法(图1 c)，从血液扩增到肿瘤和NAT样本的双扩增与较高的淋巴细胞浸润有关(图1 d)。值得注意的是，在克隆扩增较强的患者中，组织中的双扩增克隆也可在血液中检测到同样的扩增克隆（图1e）。 scTCR-seq数据使研究在克隆水平上得以进行观察而不是单个T细胞。通过研究克隆，作者发现在本实验数据集以及两个外部数据集中，外周和肿瘤内克隆大小显著相关(P = 6.3×10−53,P = 8.2×10−10和P = 0.0038)。并且在联合数据集中也观察到这种现象，说明：外周克隆扩增与瘤内和组织内平行浸润之间存在强烈而密切的联系。
Fig.1 平行双扩增和外周克隆扩增。a.克隆扩增的散点图。圆点的大小表示血液克隆的大小，而颜色表示不同组织扩增的模式。对角线表示相等的细胞分数。垂直的线条将克隆的存在与不存在分开。b. 克隆扩增的模式图。组织和血液中的扩增模式由肿瘤(Tu)、NAT和血液(Bl)的克隆大小来定义。c. 外围克隆扩增。每个病人的条形图显示了血液扩增的细胞比例和未扩增细胞比例。d. 组织浸润。条形图显示了组织扩增克隆模式的分布，包括血依赖型(Ind)、非扩张型(Non -expanded)和扩张型(Exp)。e. 血液中组织的TCRs的检测。条形图显示了组织驻留细胞的比例。n, NAT单克隆;N, NAT多重克隆;t,肿瘤单克隆;T,肿瘤多重克隆。f-h.血液和肿瘤中克隆大小的相关性。
接下来作者使用scRNA-seq探索克隆扩增的表型，利用T细胞转录谱将相似细胞归为一类（图2a）。聚类分析鉴定出了效应T细胞（8.1Teff），效应记忆T细胞（8.2-Tem），调节T细胞（4.6a-Treg，4.6b-Treg）和驻留记忆T细胞（Trm）。驻留记忆T细胞亚群（8.3a-Trm、8.3bTrm和8.3c-Trm）分别根据低、中、高表达激活-耗竭的标记以及一些已发表的基因特征进行鉴别，这些标记包括PD1(也称为PDCD1)。亚群8.3c低表达激活标记物XCL1 (编码淋巴细胞趋化因子)，而8.3b高表达KLRC2(也称为NKG2-C)和KLRC3 (NKG2-E)。此外，相较于对照组NAT，8.3a至8.3c亚群的肿瘤患病率也随之增加，这一结果支持PD1表达、终末耗竭和肿瘤微环境中同源抗原暴露增加之间的关系。另外作者发现了几类T细胞无法与已经发表的参考基因特征相匹配，随后作者使用基因富集分析（GSEA）鉴定这几类T细胞的特征，结果显示：组蛋白修饰和有丝分裂通路在8.4和8.5簇中激活。长链非编码RNA MALAT113和染色质重组酶CHD1的高表达证实了在8.4簇中染色质调控的激活。3.1簇表达丰富的线粒体基因，作者将该簇作为CD3+的泛型细胞。簇8.4-Chrom和8.5-Mitosis与Trm细胞有相似之处，即表达一定水平的细胞耗竭标记物ITGAE和PD1。同时，8.5-Mitosis也表达耗竭T细胞的标记物。但是，8.4-Chrom和8.5-Mitosis的Trm特征得分都不高，作者认为其是耗竭T细胞的主要来源。结合scTCR-seq和scRNA-seq数据，深入了解克隆和T细胞的克隆扩增行为。然而这种联合分析的一个挑战是：扩增行为是由克隆引起的，但群集分类是根据其单个细胞的转录谱。因此，一个给定的克隆可能包括不同的T细胞表型，即克隆表现出一定的转录多样性：某些同质性的克隆由单个集群组成,而某些异质性的克隆存在多个集群混合。然而,大多数克隆以一个主集群成为主导,作为近似表型用于后续分析。克隆被分为CD8+或CD4+两种类型，分别表现出不同的组织扩张行为。以8.1T、8.2T和8.3 T细胞为主的克隆大部分为双扩增（图2b），而CD4+ T细胞克隆一般为单克隆，也有部分例外:(1) 4.4-FOS克隆表现为低水平双扩增克隆;(2) 4.1-Trm克隆表现为肿瘤和NAT多重扩增克隆;(3) 4.5-IL6ST和4.6-Treg克隆表现为肿瘤多克隆扩增。同时，作者也发现簇8.4、8.5和8.6在组织中几乎没有克隆扩增。作者进一步通过分析外部数据集也得到了相似的结果。接下来作者将有外周血标本的4位患者的主类映射到克隆上，观察到8.1-Teff克隆平行双扩增。为了研究这种相关性，作者根据患者的血液扩增模式和主类(图2c)对克隆进行了重新分类，发现8.1-Teff克隆与肿瘤和NAT克隆大小之间存在显著的相关性(P= 9×10−14)。同时8.1-Teff克隆数量更多，是唯一一个显示出血液扩增与双扩增克隆大小有统计学关系的克隆(图2d，P = 1.4×10−5和P = 3.0×10−5)，表明8.1-Teff在外周克隆扩增和肿瘤浸润中起主导作用。
Fig.2 T细胞聚类和克隆扩增。 a. 聚类分析。对14例患者的所有T细胞的scRNA-seq数据采用UMAP方法降维，并通过分配着色。曲线将CD8(左)和CD4(右)T细胞的分开。b. 组织扩增模式。通过与聚类分析一致的UMAP绘制肿瘤和NAT中的T细胞克隆型。c. 不同簇的克隆扩增模式。坐标表示NAT和肿瘤克隆大小，圆点大小表示血液克隆大小。d. 分析8.1-Teff克隆，肿瘤和NAT中不同组织扩增模式克隆大小在血液无关的、非扩增的和扩增克隆的分布
血液扩增的8.1-Teff克隆不仅在肿瘤浸润中起作用，同时对向其他T细胞表型分化中也有作用。尽管血液中扩增的8.1-Teff克隆只占所有克隆的一小部分, 但它们对血液和肿瘤中的T细胞组成有不可或缺的影响。由于作者的数据只捕获了肿瘤，NAT和blood中单个克隆的快照，表示积累的各种动态过程。为了了解这些动态，作者分析了基底细胞癌治疗前后T细胞的两组外部数据，发现治疗后出现了治疗前不存在的新克隆，然后将治疗后的新克隆与治疗前血液中已有的克隆进行匹配。作者发现在新的CD8+细胞克隆大小和转录计数之间存在相关性(P= 2.3×10−8和P= 1.3×10−30)(图3a)，但未见新的CD4+细胞，这表明至少有一部分新的CD8+克隆起源于外周。虽然患者的新克隆在数量和扩增方面有了很大的差异，但这些差异与外周血中克隆多样性的程度有关(图3b)， 进一步支持外周和瘤内克隆扩增之间的关系。值得注意的是，作者在两个外周克隆多样性最高的患者中观察到外周血与耗竭表型的相互作用的一个统计上显著性差异 (P= 3.8×10−16和P= 2.2×10−11) (图3c)，未耗竭的克隆更可能与血液相关，而耗竭克隆更可能与血液无关。此外，在治疗后，与血液相关的未衰竭克隆 (P= 3.1×10−5,P= 5.2×10−12,P= 2.0×10−14)比与血液无关的克隆体积更大。虽然可及性的资料有限，但研究者的观察结果提示了两种可能的克隆扩增模式:(1)与外周血无关的的克隆产生耗竭T细胞;(2)从相对较近的血液中将新颖的、未耗竭的克隆浸润进入肿瘤。
Fig.3 外周克隆扩增和新的瘤内克隆。a. 肿瘤和血液中克隆大小的相关性。治疗后肿瘤克隆大小和治疗前血液中的转录本计数的散点图（两个病人）。垂直线左边为血液无关的克隆，右边为血液相关的克隆。b. 血液克隆多样性和新克隆。患者治疗后新的CD8克隆(顶部)总数和新细胞(底部)的总数代表血液克隆多样性的函数(治疗前和治疗后测量的平均值)。c. 未耗竭的新克隆和血液的相关性。新克隆分为治疗前血液相关和血液无关，进一步将治疗后的簇分为耗竭和非耗竭的T细胞。
无论从单个基因的风险比(图4a)还是从联合特征评分的生存分析(P≤0.02)来看，拥有肿瘤多扩增和双扩增的基因特征都更长的PFS相关。为了明确CD8A与克隆扩增的混合表达的意义，作者将对CD8A的表达和扩增克隆特征评分作为双变量进行生存分析(图4b)，虽然大多数患者在两项指标上表达一致，但相对较少患者高表达CD8A低表达克隆扩增特征评分。在含有atezolizumab治疗的组别中，不一致组的PFS都比一致的PFS更短，且在一些情况下HR> 1。此外，对肿瘤多克隆和双克隆进行生存分析，说明肿瘤双扩增克隆和多扩增克隆可能在预测癌症患者预后和免疫治疗临床反应中是独立因素。
Fig.4 扩增基因特征的生存分析。a. 组织扩增特征基因风险比率。不同肿瘤组织扩增模式的基因标记在临床试验治疗组的危险比。b. CD8A高表达联合组织扩增特征评分的生存分析。
综上所述，肿瘤中的双扩增T细胞克隆及其来源的外周扩增克隆可能代表了免疫反应的整体强度，或代表了免疫系统对肿瘤或外来抗原的“设定值”。作者提出的这种假设机制替代了免疫检查点抑制剂作用于受刺激的T细胞，以逆转T细胞终末分化或“耗竭”状态假说。总的来说，未耗竭的T细胞和来自外周的T细胞克隆是解释患者的异质性和免疫治疗临床收益的关键因素。患者的临床获益可能的机制为PD-1和PD-L1直接封闭了效应T细胞或其他的未耗竭的T细胞，或者因为封闭可以增加抗肿瘤T细胞的效应。本研究的一个现实意义是，肿瘤中TCR的双扩增克隆与外周血中的扩增克隆之间具有相关性，这表明从血液中取样和鉴别扩增克隆可以用于鉴定临床相关的瘤内T细胞中的TCR的组成，为肿瘤的液体活检提供了可能性。
作者利用scRNA-seq和sc TCR技术探讨了不同癌症肿瘤、邻近正常组织和外周血中各种T细胞和T细胞受体种群的分布。作者在多个数据集中发现外周克隆扩增与瘤内和组织内平行浸润之间存在强烈而密切的联系并进行了验证，说明肿瘤和组织中的T细胞可能来自于外周T细胞的平行扩增浸润，为肿瘤的液体活检提供了新思路。接下来作者通过探讨T细胞与外周扩增和双克隆扩增之间的相关性，发现8.1-Teff在外周克隆扩增和肿瘤浸润中起主导作用。作者进一步通过对细胞耗竭标记物进行分析发现耗竭T细胞的主要来源于8.4-Chrom和8.5-Mitosis，但是未耗竭的、血液扩增克隆相关的T细胞克隆与肿瘤浸润更相关。总之，作者提出可以通过对外周血中的扩增克隆进行鉴别进而预测肿瘤患者免疫治疗的临床获益和预后。
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