科研 | Food Chemistry：通过转录组学比较揭示了中国晋江黄牛死后早期肌肉特异性分子的差异（国人作品）
编译：陈佩佩，编辑：小菌菌、江舜尧。
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目前的研究对于牛肉中腰长肌(LL)和腰大肌(PM)之间的功能基因表达差异尚不清楚。本研究通过高通量Illumina Hiseq 4000测序揭示黄牛在死后早期牛肉中LL和PM转录组差异。层次聚类分析表明，在LL和PM之间，以及在死后1 h和 12 h之间，转录组图谱存在显著不同。在LL和PM之间共有65个基因表达存在显著差异（fold change ≥ 3, and p< 0.05；LL和PM中分别有34个和31个基因表达上调），其中大部分基因（53个基因）表达差异发生在死后的12 h。这些差异表达基因主要涉及能量产生和转化、核苷酸代谢、翻译后修饰和转录。KEGG 分析发现氧化磷酸化是重要途径之一。本研究从转录组学角度探讨牛肉中LL和PM中基因表达的不同，为揭示与基因表达相关的特异性分子差异与牛肉质量相关的潜在机制提供了新的思路。
论文ID
DOI号：10.1016/j.foodchem.2019.125262
实验设计
1. 样品采集
分别于黄牛死后的1 h、12 h和24 h采集肌肉的LL和PM。所有收集的样品立即浸没在液氮中，并保存在-80 ℃，用于后续测序分析。
2. 提取RNA
用试剂盒提取总RNA，然后对RNA进行定量。
3. Illumina Hiseq 4000 测序
RNA经定量后，用Illumina HiSeq 4000对RNA-seq双端测序文库进行测序（读长2×150 bp）。
4 .读取映射
TopHat（http://tophat.cbcb.umd.edu/2.0.0版）软件用来将clean reads分别与参考基因组（Bos_taurus,UMD3.1）进行对比。
5. 数据分析
把3个比较组（LL与PM分别在 1 h、12 h 和 24 h）中最小倍数变化为 3且p < 0.05的基因丰度设定为显著差异表达。进行主成分分析 (PCA) 和层次聚类分析 (HCA)，评估LL和PM样本转录组图谱的相似性和差异性。并通过GO数据库运行每个DEG查询的GO分析和KEGG 功能富集分析。
结果
从LL和PM样本中平均获得51,628,755个原始读数，clean reads平均为 50,935,200个。所有下游分析均基于高质量的cleanreads，错误率均小于0.029%。将Clean reads映射到黄牛参考基因组序列，并将文库中大约92.01%−96.37%的 Clean reads映射到黄牛参考基因组。
2. 转录组学数据分析与比较
利用HCA分析（图1），排除来自LL和PM的不同样本内以及三个样本采集时间对的转录组结果的影响。PM肌肉样品，在死后12 h和24 h显示出相似的转录组分布，并首先聚集成一个簇。LL肌肉样品也具有相同的趋势，在死后12 h和24 h聚集在一起。随着欧氏距离的增加，12 h和24 h的LL和PM样品聚集成簇，并与1 h样品分离，表明在早期死后，特别是在死后12 h内转录组发生了显著的变化。由于LL和PM肌肉其肌纤维类型不同，甚至在死后12 h内可能出现特异性的改变。
图1 LL和PM肌肉转录组图谱的层次聚类分析。
热图显示具有不同颜色的基因的平均相对丰度 (n = 6)
PCA分析用于可视化LL和 PM样本之间的转录组图谱差异。死后1 h PCA 分析的评分图（图2a）显示48.9 %的变异性由前两个主成分解释，分别占总方差的25.9 %和23 %。LL和PM的PCA图被分开，表明在死后1 h在这两种不同的肌肉之间转录存在差异。同时，死后12 h和24 h的LL和PM的成对比较结果均与1 h内发生的结果一致，表明它们之间在早期死后期间存在差异表达基因。
此外，散点图（图2b）显示具有不同差异表达基因，其中红色表示基因在LL上调，而蓝色表示基因在PM上调。在不同死后时间的LL和PM肌肉之间的成对比较中，共有65个基因表达异常（fold change ≥3, and p< 0.05; 34个基因在LL中表达上调，31个在PM中表达上调）, 其中大多数（53个基因）发生在死后12 h。因此，推测宰后12 h或12 h以内可能是宰后牛肉发生生化反应的关键时间点。
图2 肌肉采集时间点为1 h时 LL和PM的 PCA得分图。a.死后1 h的LL和 PM 散点图; b.其中红色标记表示这些基因在 LL中上调，蓝色标记表示在 PM 中上调
与肌纤维结构相关基因：死后12 h，与PM相比，MYL6B基因在LL肌肉中上调。而与LL相比，PM肌肉中MYL3上调。MYBPC2编码相应的肌球蛋白结合蛋白C，参与肌肉收缩。死后12 h和24 h，在LL肌肉中检测到该基因的高表达。与死后24 h PM相比，LL肌肉中TPM1基因表达上调1.635倍。
参与钙结合和转运的基因：CALN1蛋白在Ca2+信号转导中起关键作用。LL 中CALN1表达比PM高4倍以上。当动物被宰杀时，肌肉pH值下降，内质网/肌浆网失去结合钙的能力，因此，肌浆中的钙水平和钙蛋白酶活性增加。
与能量产生和转化有关的基因：4个基因（MT-ND2,coⅡ,ND4L和BDH1）在死后12 h的PM样品中检测到显著较高的表达。其中3个 (MT-ND2、coⅡ、ND4L) 参与线粒体电子传递链。肌肉中线粒体浓度依赖于其纤维类型，PM 肌肉比 LL有更多的线粒体和肌红蛋白，因此应该在 PM 肌肉中检测到更多与线粒体有关的基因。
参与化合物转运和代谢的基因：检测到10个与化合物转运和代谢相关的基因 LL和PM样本中显著差异表达（6个在LL中高度表达，4例在PM中过度表达）。SLC7A8蛋白在细胞膜中表达，并在一定程度上在细胞质中表达，它能转运大的中性氨基酸（如酪氨酸、色氨酸和丙氨酸）穿过细胞膜。与 PM 相比，LL 肌肉中 SLC7A8 的表达上调可能表明 LL 中产生了更多的中性氨基酸或更强的氨基酸转运活性。
与转录相关的基因：与PM相比，参与转录的4个基因在LL肌肉中表达上调，特别是HOXC6和HOXC8无论在死后时间点都表现出超过2倍的增加。所有这些基因都可以与RNA聚合酶II转录基因调控区域内的特定DNA序列选择性地、非共价地相互作用，激活或增加转录。同时，在PM肌肉中检测到7个转录相关基因的显著高表达，尤其是在IRX3、IRX5、PITX1和HOXC11上，在 PM死后24 h内上调。这些基因的分子功能主要涉及DNA结合、RNA聚合酶 Ⅱ 转录因子结合、转录因子结合。因此，可以假设，在死后早期，转录可能在肌肉中持续发生一段时间，并对后段的生物过程发挥其功能。
参与翻译后修饰的基因：两个基因（PADI2和MAB21L1）被注释具有翻译后修饰、蛋白转换和分子伴侣的功能，在LL样本中检测到较高的表达。特别是 PADI2在整个死后24 h的LL中表达显著增高，特别是12 h和24 h，超过3倍。这些基因主要参与染色质解体、蛋白瓜氨酸化和染色质介导的转录维持的调控。
核苷酸代谢相关基因：4个基因（ABCG4,PRKAG3,ARHGAP36, 和 PDE7A）在LL肌肉中的表达高于PM。而ABCA13和RND2在PM样本中检测到较高的表达。ABCG4和ABCA13的分子功能均涉及ATP结合、脂质转运蛋白活性和 ATP酶活性，催化ATP和H2O转化为ADP和磷酸盐。由于肌纤维中糖原含量、肌纤维代谢类型、ATP水解进程等因素的不同，尸僵的发生和持续时间与肌纤维类型有很大关系。因此，参与核苷酸代谢的基因差异可能导致死后代谢速率和程度的不同。肌肉类型的差异对宰后新陈代谢的影响及其对肉质的影响有待进一步研究。
3. 生物信息学分析
在本研究中，总共有65个差异表达基因被用于GO注释分析。关于生物过程，73.85%的基因被注释到单有机体过程 (GO：0044699)，46.15%的基因参与代谢过程 (GO：0008152)（图3）。就细胞成分而言，76.92%的基因（65个基因中的50个）位于细胞和细胞内部，41.54%的基因位于膜。对于分子功能，39个基因涉及结合功能 (GO：0005488)，而20个基因具有催化活性 (GO：0003824)。转录组学和蛋白质组学研究结果表明，肌肉转化为肉的过程中，LL和PM之间存在明显的代谢差异。这主要是由于肌纤维的分化。
图3 差异表达基因的GO注释分析
KEGG富集分析表明有7条重要途径p < 0.05（图4），最主要的途径是糖胺聚糖生物合成-硫酸肝素/肝素。氧化磷酸化是与蛋白质组学结果一致的重要通路。线粒体是氧化磷酸化和ATP产生的主要场所，它将继续代谢死后肌肉中的氧，尽管肉的耗氧量有随时间增加而减少的趋势。
图4 KEGG通路富集分析不同表达基因
讨论
评论
高通量转录组学是探索生物系统中完整的转录组的一种整体研究方法。已有研究通过蛋白质组学和代谢组学方法研究了宰后保存过程中LL和PM变色的潜在机制和影响肉质的因素。然而，使用高通量测序阐明与肉质相关的潜在机制的牛LL和PM肌肉之间的全面转录组比较尚未进行。本研究通过转录组学研究方法与技术手段，对中国晋江黄牛LL和PM肌肉在屠宰后1，12，24小时后转录组的变化，并分析了65个基因表达存在显著差异。这些基因表达的差异，可以为LL和PM肌肉存放保存和肉质品质提供可能的解释。总而言之，本研究通过转录组学的方法探索了早期宰杀后肉类基因表达的差异。将转录组学的方法运用到了食品行业的研究过程中。