科研 | BMC Genomics：转录组结合代谢组学分析揭示了高羊茅中一氧化氮调节镉胁迫适应的关键因素（国人佳作）
编译：Mr. Left，编辑：景行、江舜尧。
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论文ID
原名：Comparative transcriptome combined with metabolome analyses revealed key factors involved in nitric oxide (NO)-regulated cadmium stress adaptation in tall fescue
译名：比较转录组结合代谢组学分析揭示了高羊茅中一氧化氮（NO）调节镉胁迫适应的关键因素
通讯作者单位：中南民族大学，中国科学院武汉植物园
实验设计
结果
1 NO补充减少了Cd积累
为了检测研究中使用的不同处理方法的效果，测定了NO含量（图1，表1，表S1，S2和S3）。通过双因素方差分析和LSD检验，在使用或未使用Cd处理的根之间，NO含量存在显著差异。在添加NO供体（SNP和T1处理），NO产生抑制剂和NO清除剂（L-NAME+c-PTIO和T2处理）以及不添加NO供体，抑制剂或清除剂（对照和Cd处理）的组之间，NO水平也存在显著差异。但是，Cd×NO水平显著着差异（表1）。L-NAME加c-PTIO处理的根中NO含量显著低于对照（表S1，表S3）。相比之下，与对照相比，单独使用SNP处理可显著增加根中的NO含量。而且，与对照相比，在Cd处理的植物中，根中的NO含量显著增加。与Cd处理相比，当用Cd+NO供体SNP（T1）处理植物时，NO积累进一步增加，而暴露于Cd，L-NAME+c-PTIO（T2）的根中NO积累明显减少。这些结果表明，以上NO相关试剂处理和Cd处理均能有效影响羊茅根的内源NO含量。为了进一步研究高羊茅中NO调节的Cd胁迫适应性，作者集中于4个处理组，包括对照组，Cd，T1和T2。相对于单独的Cd处理，高羊茅根中的Cd含量在T1处理下降低了11％（图2）。相反，当用c-PTIO和L-NAME处理植物时，Cd含量显著增加24.2％。此外，Cd，T1和T2处理组的根干重和根长没有显著差异，这可能是由于短时处理（48小时）所致。这些结果表明，NO可以有效减少高羊茅根中Cd的积累。
图1 高羊茅根中的NO含量。高羊茅根上带有敏感的荧光染料DAF-FM DA。a和b分别代表明场和荧光场。每张照片的下角都有一个长度为50 μm的比例尺。
表1 除L-NAME处理和c-PTIO处理外，高羊茅根部相对荧光强度的双因素方差分析结果。
图2 在四种不同处理下高羊茅根中的Cd含量。有4种处理，包括对照（Con），Cd，T1和T2处理。数值以平均值±SE（n =3）表示。有关Cd，T1和T2处理的数据使用单因素方差分析进行分析，然后进行LSD检验。*表示P <0.05时的显著差异。
2 转录组分析
为了研究高羊茅中NO引起的Cd解毒的分子机制，进行了转录组分析。总共构建了12个RNA-seq文库并进行了测序，以鉴定对高羊茅根中对Cd胁迫响应的DEG，无论是否经过NO处理。表S4显示了从12个文库获得的RNA-Seq片段的概述。从高质量的片段中总共检索了2,005,577个转录本。转录本的长度在201 bp至16784 bp之间，平均长度为680 bp。从这些转录本中总共获得968,924个独立基因，平均长度为475 bp，N50长度为560 bp（表S5）。根据从头组装，在T1与Cd的比较中总共鉴定了904个DEG（414个上调，而490个下调），但在T2与Cd的比较中仅发现了118个DEG（74个上调和44个下调）（图S1）。此外，发现在Cd与对照比较中差异表达了1482个基因（591个上调基因和891个下调基因）。同时，为了证实Illumina RNA-Seq的可靠性，选择了一些参与不同生物学过程的DEG，并通过qRT-PCR分析进行了检测。qRT-PCR结果与RNA-Seq的强相关性（r = 0.8935）表明RNA-Seq准确有效，如图S8所示。通过进行GO功能和富集分析以对DEG的功能进行分类（图S2）。结果表明，生物过程（BP）在GO类别中最丰富，而代谢过程在该类别中占主导地位。分子功能（MF）是第二丰富的，高代表性的GO术语是氧化还原酶活性，金属离子结合和阳离子结合。细胞组分（CC）是GO分类中丰富性最低的类别。此外，与背景水平相比，使用KEGG数据库显著富集了DEG数（p <0.05）。使用散点图法显示了富集的KEGG途径（图3）。根据它们的富集因子，最丰富的八种途径从大到小与“二苯乙烯类化合物，二苯基庚烷和姜酚的生物合成”，“牛磺酸和亚牛磺酸的代谢”，“黄酮的生物合成”，“α-亚麻酸代谢”，“酪氨酸代谢”，“氮代谢”，“赖氨酸生物合成”和“硫代谢”相关。
图3 高羊茅根中响应T1处理DEG的散点图分析。高羊茅幼苗分别在含
50 mg/L Cd2+（CdCl2·2.5H2O）的1/2 Hoagland溶液（Cd处理）和含50 mg/L Cd2+和200 μM SNP的1/2 Hoagland溶液中（T1处理）培养。每个值是三个重复的平均值。
通过气相色谱/飞行时间质谱（GC-TOF-MS）鉴定Cd胁迫下高羊茅中外源NO调节的差异表达代谢物。在T1与Cd的比较中总共检测到823种代谢产物。总共99种代谢物，与Cd处理相比，主要包括氨基酸及其衍生物（14），黄酮（18），花色苷（11），酚酰胺（7），有机酸及其衍生物（4），糖（3）和其他代谢物（42）对T1处理有显著响应（VIP ≥ 1，倍数变化≥2或倍数变化≤0.5）（表S6）。对于这些差异表达的代谢物，65种代谢物被上调，而34种代谢物被下调。此外，在T2与Cd对比组中鉴定出131种差异表达代谢产物（45个上调和86个下调），在Cd与对照比较组中鉴定出197种差异表达代谢产物（161个上调和36个下调）。此外，大多数检测到的化合物都响应NO处理而发生了变化（图S3），最突出的是次级代谢产物，尤其是花青素和黄酮。在T1与Cd的比较中，甲基花青素（Fes0607）和野漆树苷（Fes1007）分别上调了360.7和99.9倍。但是，与对照组相比，甲基花青素的下调在Cd中要高达2525倍。另一方面，在T1与Cd的比较中，黄酮代谢物刺槐素（Acs1079）和樱草素（Fes1078）大量下调（表S7）。主成分分析（PCA）显示，第一和第二主成分分别占总方差的27.63%和14.27％（图S4）。此外，第一主成分显示出对照处理与含Cd处理（包括Cd，T1和T2）的分离。另外，第二主成分暗示样品通过外源NO处理或被抑制NO产生。对代谢物谱的PCA分析表明，所有处理过的样品均已清晰分离。同时，层次聚类分析（HCA）的结果表明，所有对照样品系均聚类为一个单独的组（图4）。相反，其他处理系没有形成单个簇。重要的是两个Cd处理系和两个T2处理系以相同的方式聚集，这表明在大类别中，NO水平可能更低且更接近Cd处理。
图4 高羊茅中代谢物谱的层次聚类分析（HCA）。在本研究中，有4种处理方案，包括Con，Cd治疗，T1治疗和T2治疗，每种方案都有3个重复。四种处理分别代表高羊茅培养在1/2 Hoagland溶液（Con），1/2 Hoagland溶液和50 mg/L Cd2+（CdCl2·2.5H2O）（Cd处理），1/2 Hoagland溶液和50 mg/L Cd2+和200 μM SNP（T1处理），以及1/2 Hoagland溶液和50 mg/L Cd2+，200 μM L-NAME和100 μM c-PTIO（T2处理）中培养。
4 代谢组学和转录组学相关性概述
在代谢组学和转录组学数据之间进行了相关分析，以进一步揭示NO在植物Cd胁迫响应中的作用。通过对用或不用NO处理的所有数据进行综合分析，将重点放在T1和Cd处理之间的相关基因和代谢物上。对T1和Cd处理之间的转录组和代谢组的综合分析表明，904个DEG中有81个与代谢产物具有丰富的相关性，主要包括GST，硝酸还原酶（NAD（P）H），反肉桂酸酯4-单加氧酶和ABC转运蛋白。此外，检测到的255种代谢物被富集，但只有15种代谢物差异表达。注释的代谢物数据以热图形式显示（图S5）。三个簇提供了有关Cd胁迫下不同NO响应的信息。中部簇的代谢物主要涉及氨基酸，尤其是L-焦谷氨酸（Fes0791）。其在T1处理下显示出比Cd处理更高的水平。差异表达的基因和代谢物在相同的KEGG途径中富集，包括苯丙素生物合成，氮代谢，黄酮和黄酮醇生物合成以及ABC转运蛋白（图5，图S6和表S8）。DEG主要涉及抗氧化系统，次级代谢途径，氮代谢和金属离子转运机制，这表明NO通过一系列防御机制缓解了Cd胁迫。
图5 高羊茅响应T1处理和Cd处理的差异表达相关基因和代谢物的直方图。高羊茅幼苗分别在含50 mg/L Cd2+（CdCl2·2.5H2O）的1/2 Hoagland溶液中（Cd处理）和分别含50 mg/L Cd2+和200 μM SNP的1/2 Hoagland溶液中（T1处理）培养。每个值是三个重复的平均值。
分析了与次生代谢途径相关的转录本与代谢物之间的相关性，例如用于苯丙素生物合成（反式肉桂酸），黄酮类生物合成（异槲皮甙和刺槐素）和有机酸（2，5-二羟基苯甲酸）。另一方面，发现了与氮代谢和某些氨基酸生物合成（L-瓜氨酸，L-焦谷氨酸和L-丙氨酸）有关的途径之间的相关性。
为了更清楚地了解差异表达基因与代谢物之间的相互作用，选择了一些相关的DEG映射到相关的代谢途径中。在T1与Cd的比较中，观察到了途径之间的相关性，例如苯丙素生物合成以及黄酮和黄酮醇生物合成（图6）。与苯丙素生物合成有关的转录本与代谢产物反式肉桂酸显示出最高的负相关性。在从反式肉桂酸到4-香豆酸的途径中，反式肉桂酸和位于反式肉桂酸下游的编码CYP73A的基因被上调。反式肉桂酸含量的上调可能与CYP73A的转录增加有关。据报道，与用重金属处理的植物相比，反式肉桂酸改善了植物的生长并显示出相反的作用。此外，一些相互关联的DEG（TRINITY_DN367754_c1_g1，TRINITY_DN359843_c1_g1，TRINITY_DN359843_c2_g1，TRINITY_DN380055_c1_g4和TRINITY_DN380055_c1_g2）不仅在T1与Cd比较中上调，在T2与Cd比较组中也上调。令人惊讶的是，在T2与Cd的比较中，异槲皮甙的水平增加了4倍以上，而在T1与Cd的比较中却观察到相反的趋势。同时，在T1与Cd的比较中，位于异槲皮甙上游的编码CYP75A的基因被下调。然而，在T2与Cd比较中，编码CYP75A的基因没有改变。因此，作者推测CYP75A基因的表达下调间接引起了异槲皮甙的下降。此外，有机酸2，5-二羟基苯甲酸显示出与异槲皮甙相似的表达模式。所有相关基因都与ADH1（一种乙醇脱氢酶）相关，可催化丙酮酸转化为乙醇。另外，所有ADH1相关基因均被上调，但在T1处理中仅编码类黄酮3'，5'-羟化酶（CYP75A）的基因被下调。
图6 高羊茅T1处理与Cd处理某些途径相关步骤的简化示意图。高羊茅幼苗分别在含50 mg/L Cd2+（CdCl2·2.5H2O）的1/2 Hoagland溶液中（Cd处理）和含50 mg/L Cd2+和200 μM SNP的1/2 Hoagland溶液中（T1处理）种植。绿色标签显示下调的基因或代谢物，红色标签显示上调的基因或代谢物。实心箭头表示所指示的代谢物的生物合成是单一路径。虚线箭头表示代谢物的生物合成是多路径的。
毫无疑问，SNP的施用将参与氮代谢。另外，据报道SNP的施用可以通过其对氮代谢的影响来保护植物免受非生物胁迫。因此，很明显在T1处理中发现了代谢组和转录组之间氮代谢的相关性。在这种情况下，很明显硝酸还原酶（TRINITY_DN380554_c0_g2， TRINITY_DN348032_c3_g1和TRINITY_DN367739_c0_g2）作为第一个被鉴定出的NO生物合成酶，与Cd处理相比，在T1与T2条件下被上调，且L-瓜氨酸（NO伴随产物）的浓度有所增加。参与NO生成机制的一些基因也发生了变化。编码精氨酸酶的基因被下调，一些硝酸盐或亚硝酸盐转运蛋白（NRT）明显被上调。同样，ABC伴侣家族的两个转运蛋白成员（ABCB1和ABCC10）也明显被上调。
讨论
在本研究中，整合了转录组学和代谢组学数据，以研究高羊茅中NO介导的Cd解毒的分子机制。从T1与Cd的比较中筛选出总共81个DEG和15种不同相关的代谢物。结果表明，NO处理后诱导特定的基因和代谢产物抵消了Cd胁迫。此外，代谢物主要参与防御机制，例如增加抗氧化能力，排泄更多的次生代谢物以螯合和隔离Cd，并调节某些转运蛋白以减少Cd的吸收，如图2所示。
1 提高抗氧化能力的机理
黄酮是具有保护性生化功能的天然代谢产物，在最近的研究中大多得到证实。众所周知，类黄酮对重金属的保护作用主要归因于三种机制，包括清除活性氧，螯合重金属和减少DNA损伤。在本研究，T1与Cd比较的综合数据分析表明，类黄酮异槲皮甙和刺槐素的表达下调。类似地，编码类黄酮3'，5'-羟化酶的基因在T1与Cd比较组中被下调，但在T2与Cd比较中没有变化。相反，在T2与Cd的比较中，异槲皮甙的水平增加了4倍以上。在T1和T2处理之间，异槲皮甙的含量存在很大差异。据推测，作为非酶抗氧化剂的异槲皮甙与过氧化物酶和过氧化氢酶等酶抗氧化剂竞争而使ROS猝灭。可能的证据是在T1与Cd比较下下，大多数编码酶抗氧化剂的基因上调，如过氧化氢酶；或编码类黄酮3'，5'-羟化酶的基因（CYP75A）下调，导致黄酮生物合成下降。根据一项类似的研究，通过SNP处理可提高作为非酶抗氧化剂的Cu和总酚的含量，但通过Cu和SNP同时处理而减少。而且，这些结果暗示着NO提高抗氧化能力的机制有多种，包括间接调节与酶促抗氧化剂有关的基因或利用非酶促抗氧化剂清除ROS并直接保护细胞免受氧化损伤。
2 次生代谢物螯合和隔离镉
在Cd胁迫下，植物的生长受到抑制，并观察到次生代谢物水平的变化。当植物受到重金属胁迫时，这是防御策略机制之一。此外，一些研究表明，Cd和Cu的毒性将某些底物从初级代谢物转化为次级防御性化合物，从而诱导了次级代谢物的产生。但是，NO供体SNP可影响次生代谢产物的生物成。此外，主要涉及一些次生代谢物，如苯丙素和黄酮，用于螯合金属离子，这是胁迫植物中可能的作用机理之一。如苯丙烷素生物合成途径所示，木质素上游的编码过氧化物酶（POD）的转录本数量减少，这暗示在长期Cd处理过程中，NO可能会影响木质素对Cd的吸收。此外，苯丙素途径负责木质素，类黄酮和苯类化合物等的生物合成，它们均在保护植物免受生物和非生物胁迫方面起作用。反式肉桂酸在苯丙氨酸催化生成次生代谢物（如木质素）的过程中作为一种介质，这表明其在苯丙素生物合成途径中的关键作用。在本研究中，作为许多次要物质前体的反式肉桂酸在T1与Cd比较中被上调，但在T2与Cd比较中被下调。该发现表明反式肉桂酸可以减轻高羊茅中的Cd胁迫。研究表明，与单独的胁迫处理相比，向受胁迫的植物中添加反肉桂酸具有相反的作用。在一些植物中，外源反式肉桂酸通过抑制苯丙氨酸氨解酶以减少作为金属螯合剂的苯丙烷而降低了Cu或Cd的吸收。此外，反式肉桂酸水平也解释了Cd含量的差异（图2）。此外，反式肉桂酸的含量可能会影响黄酮类化合物，它们位于苯丙素途径的下游。在相关分析中，作者筛选了类似的苯丙素生物合成和反式肉桂酸的基因，其中大多数是CYP超家族的一部分，例如CYP73A（反式肉桂酸4-单加氧酶）和CYP84A（阿魏酸5-羟化酶）。反式肉桂酸4-单加氧酶，也称为肉桂酸4-羟化酶（C4H），作为细胞色素P450单加氧酶（P450s）的成员参与了许多类多酚化合物的合成，如类黄酮和木质素。此外，转录本还调节了苯丙素生物合成途径中相关次生代谢物的合成，如CCR（编码肉桂酰辅酶A还原酶），其对T1处理表现出强烈的反应，表明苯丙素生物合成途径可能在防御机制中起重要作用。许多研究已经揭示了相似的重要性。CYP73A9v1和CYP82A1v2基因的研究已经阐明了豌豆植物防御的复杂分子特征。此外，已发现CYP71、72和99家族是多年生黑麦草和高羊茅中的温度响应基因。另外，显示出SoCYP85A1可增强番茄的根系发育和干旱胁迫耐受性。
另外，上面已经讨论了黄酮在清除ROS中的作用，而先前的研究表明，具有适当结构特征的黄酮是有效的Cu螯合剂。不幸的是，在相关分析中，黄酮和黄酮醇生物合成中涉及的代谢物和基因被下调。或许，像黄酮这样的螯合剂越少，T1与Cd比较下的Cd含量就越少。类似的研究发现，与Cd处理相比，SNP处理中的Cd含量降低，而c-PTIO处理中的Cd含量增加。结果与本研究对Cd的吸收研究一致。当然，原因是多种多样的。类黄酮的积累可能取决于Cd污染物水平和Cd暴露时间。因此，在随后的研究中必须研究更详细的机制。
3 NO调节的ABC转运蛋白途径参与调节Cd胁迫
随着外源NO的应用，植物发展出了多种机制来防御重金属胁迫。适应性机制的最终目标是通过使用植物螯合肽与有毒离子结合，然后将其隔离在液泡中。在这些机制中，膜转运蛋白系统的调节在金属胁迫响应过程中至关重要。特别是，在本研究中，某些代谢物高度活化了ABC转运蛋白。如表S6所示，由外源NO诱导的肉碱和L-丙氨酸被上调。另外，细菌中的发现表明，与ABC转运蛋白有关的代谢产物可以使络合或螯合Cd2+为低分子量有机酸，这可能表明它们在减轻Cd胁迫中的关键作用。根据代谢产物的结果，包括ABCB1和ABCC10在内的ABC转运蛋白大量积累在SNP处理的高羊茅根中。最近，已经在植物对各种胁迫的响应中揭示了ABCB转运蛋白的生物学功能。生长素转运蛋白基因ClABCB在NaCl处理或PEG处理后在根中被上调。同样，已经在各种植物中发现了ABCC转运蛋白，例如玉米和小麦。以上报告显示了ABC转运蛋白的重要作用，并提出了进一步表征其生物学意义的倡议。此外，GA3实质上诱导了TaABCC3，其是植物基因工程中增强耐受性的主要候选基因。在其他研究（AtABCC13/ABCC11）中也观察到了类似的结果。ABCC基因在多种非生物胁迫下的整合途径中起着关键作用，并且已经研究了一些其他信号分子（即ABA和MeJA）对其转录本积累的影响。因此，作者推测NO是一种多功能信号分子，在调节ABC转运蛋白以改善Cd转运和解毒方面起着至关重要的作用。
结论
在这项研究中，代谢组和转录组的整合分析提供了对高羊茅中NO对Cd解毒的分子机制的更深入了解（图7）。NO可以调节参与氮代谢的基因和代谢物的表达，从而保护高羊茅草免受Cd胁迫。此外，NO的施用增加了编码CAT，GLT1，GST和ADH1的基因的表达，并降低了异槲皮甙和刺槐素的含量，表明NO参与了抗氧化系统的调节。此外，NO施用后上调的基因如ABCB1和ABCC10高度激活了ABC转运蛋白相关代谢产物（肉碱和L-丙氨酸）的合成，这表明NO在调节ABC转运蛋白途径以改善Cd转运和解毒中起着关键作用。此外，在本研究中发现并讨论了NO调控的次生代谢物，特别是苯丙素，黄酮和黄酮醇的生物合成。总而言之，NO施用通过增加抗氧化能力，释放更多的次生代谢物以螯合和隔离Cd并调节重金属转运蛋白而减轻了Cd胁迫引起的伤害。
图7 高羊茅中一氧化氮调节镉胁迫响应的模型
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