编译：小北，编辑：夏甘草、江舜尧。
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导读
三阴性乳腺癌(TNBC)是乳腺癌中一种致死的癌症，由于对化疗耐药的发展影响了30%的患者。急需新的治疗方法以及生物标记物。通过发现TNBC中葡萄糖转运蛋白1（GLUT1）的表达升高并且相关的代谢依赖性，研究者调查了TNBC细胞系以及病人来源的样本对GLUT1抑制的脆弱性。研究者发现利用BAY-876对GLUT1基因或者药理抑制损害了一组具有高糖和低氧化磷酸化(OXPHOS)速率的TNBC细胞的生长。对基因表达数据的信号通路富集分析提示E2F通路的功能可能在一定程度上反映OXPHOS的活性。此外，视网膜母细胞瘤肿瘤抑制因子(RB1)的蛋白水平与TNBC中GLUT1抑制的敏感性程度相关。总的来说，研究者的结果发现了在TNBC中一个强有力的并且可靶向的RB1-GLUT1代谢轴线，并且依据RB1蛋白表达水平分级的TNBC病人值得通过GLUT1抑制进行临床评估。
原名：GLUT1 inhibition blocks growth of RB1-positive triple negative breast cancer
译名：GLUT1抑制阻断RB1阳性三阴性乳腺癌的生长
期刊：Nature communication
影响因子：12.121
作者：Mathieu Lupien，Cheryl H. Arrowsmith
单位：多伦多大学
发表时间：2020年8月21日
DOI：10.1038/s41467-020-18020-8.
乳腺癌是世界范围最常见的女性癌症，据2012年的记录有170万新的病例并且超过520,000例死亡。三阴性乳腺癌（TNBC）是乳腺癌中最具侵袭力的亚型，其缺少雌激素受体α (ERα)、孕酮受体(PR)以及表皮生长因素受体2 (HER2)的表达。TNBC代表了15–20%的乳腺癌案例但是导致了25%的死亡。此外，相较于受体阳性的乳腺癌亚型，5年的诊断内TNBC具有更高的转移速率(~2.5倍)以及更差的整体生存期速率。这一差的预后可能来自疾病的异质性，加上缺乏高度复发以及可作用的生物标记物信息用于治疗。另外，一些TNBC最初是化疗敏感的，23%的病人在诊断后5年内复发并且超过30%发展为耐药的肿瘤。因此，急需提高我们对TNBC发生发展分子机制的认知，以发现有效的治疗靶向及其检测以改进病人的预后。代谢适应性是肿瘤发生所遗传的，以满足生物能量、生物合成以及肿瘤细胞解毒的需求。有氧代谢的速率增加是一些癌症细胞常见的代谢特征，并且在癌症中作为治疗的焦点一直在进行广泛的研究。在乳腺癌中，与其他乳腺癌亚型相比，TNBC细胞糖酵解的基因特征升高伴随更低的OXPHOS特征，例如激素阳性的管腔乳腺癌。葡萄糖转运蛋白1 (GLUT1)的高表达是葡萄糖摄取中一个关键的限速因子，在基底样乳腺癌亚型（TNBC中最常见的类型）中显著升高。提示GLUT1在调节TNBC细胞代谢中发挥重要的作用。利用小分子靶向GLUT1，例如STF-31, WZB-117，BAY-876已经在一些肿瘤中取得了可观的结果。通过短发夹RNA (shRNA)或WZB-117抑制剂处理抑制GLUT1具有抑制MDA-MB-231和Hs 578T TNBC细胞系的增殖效果，再次证实GLUT1可作为TNBC的一个潜在的靶向。因此急需对调节GLUT1依赖机制更加系统的研究和全面的了解，以评估临床前TNBC治疗中GLUT1抑制的药理效果。细胞内代谢固有的可塑性以及TNBCs中高度的代谢异质性为代谢靶向治疗带来了很大的挑战。近期的研究工作提示肿瘤细胞异型性代谢依赖导致了不同的治疗弱点。因此，为了使GLUT1抑制成为TNBC治疗一个成功的策略，需要确定这一代谢信号通路的确切内容。除了肿瘤微环境，代谢一例可能是由基因病变驱动的，例如myc扩增以及Kras突变体。然而促癌基因驱动的肿瘤代谢在肿瘤类型中是复杂的、特异的。预测GLUT1依赖和抑制的生物标记物在TNBC中仍然是缺乏的。在本研究中，研究者系统评估了TNBC细胞系对GLUT1抑制的脆弱点。随后研究者确定了GLUT1依赖的分子机制并且在病人来源的类器官和肿瘤移植体中得到验证。最终研究者证实RB1蛋白可作为GLUT1敏感性的预测性的生物标记物，并且可能潜在的应用于靶向GLUT1治疗TNBC病人的分级。为了检测TNBC中GLUT1的依赖性，研究者首先通过整合两个独立的临床队列TCGA 和METABRIC，探究了编码GLUT1的基因SLC2A1的表达水平是否在TNBC中升高。在检测的两个队列中，与雌激素受体阳性以及HER2扩增的乳腺肿瘤相比，SLC2A1 mRNA表达在基底样亚型中显著升高（图1a、b）。同样，PM-PDXs来源的更小的乳腺病人来源的PDX中也观察到SLC2A1的mRNA水平升高（图1c）。这些数据库中基于PAM50乳腺癌亚群分类也发现在基底样亚型中SLC2A1 mRNA的表达升高。同样，在CPTAC数据库中相较于管腔乳腺肿瘤，TNBC内GLUT1蛋白水平显著更高。为了进一步评估GLUT1作为靶向的功能以及GLUT1抑制剂作为TNBC患者治疗策略的可行性，研究者利用小分子GLUT1抑制剂BAY-876处理了17个TNBC细胞系。在已经报道的GLUT抑制剂中，BAY-876是唯一一个超过其他葡萄糖转运体对GLUT1具有较高潜能和选择性的抑制剂。在11/17个TNBC细胞系中观察到了在IC50<5μM基础上显著的生长抑制效应（图1d）尽管在正常的乳腺细胞中并未检测BAY-876，它的低毒性可以从其他几个正常细胞系以及原发性细胞的测试中进行推断。在6个耐药的TNBC细胞系中BAY-876的IC50 >10 μM，使用最大的剂量进行处理。为了补充短期处理的实验结果，研究者进行了长达14天克隆形成实验以确定BAY-876的抑制效果是否是长时间维持的。当BAY-876达到1 μM时，敏感细胞系(HCC1806和Hs 578T)受到严重抑制，而耐药细胞系(MDA-MB-436 和MDA-MB-468)没有效果。这些数据证实在TNBC细胞系中对GLUT1药理抑制的异质性应答。研究者接下来评估了siRNA介导的GLUT1沉默对细胞增殖的影响。与利用BAY-876对GLUT1进行药理抑制的结果一致，SLC2A1的沉默导致GLUT1蛋白水平的降低（图1e）以及对BAY-876敏感的TNBC细胞系(HCC1806和Hs 578T)生长受到显著损害，而对BAY-876耐药的TNBC细胞系(MDA-MB-436和MDA-MB-468)的生长没有影响（图1f）。与此一致的是，将培养基中葡萄糖部分剥夺能够选择性地损害对BAY-876敏感细胞系的生长，而对BAY-876-耐药的细胞系没有显著的影响（图1g）。研究者接下来通过对细胞周期和凋亡影响的量化描述了TNBC细胞系中BAY-876损害生长的机制。利用3 μM BAY-876处理或者敲除GLUT1，BAY-876敏感的HCC1806和Hs 578T细胞系证实在S期适度但是显著的降低，而G1期升高（图1h）。相反，MDA-MB-436 和MDA-MB-468细胞在细胞周期进程中并未发现显著的改变（图1h）。此外，caspase 3/7染色的结果发现在BAY-876处理或者敲除GLUT1，BAY-876敏感的细胞系凋亡细胞的数量显著升高（图1i、j）。总之，这些结果证实通过siRNA调节的GLUT1沉默或者利用BAY-876处理的药理抑制都导致细胞生长和增殖的减弱、细胞停滞增加、细胞凋亡增加，最终共同导致TNBC细胞的生长受到抑制。
图1 一组TNBC的生长依赖于GLUT1的活性
研究者的结果提示BAY-876的处理能够选择性的损害TNBC细胞系的生长，研究者评估了赋予这一GLUT1抑制的异质性应答的机制。因为葡萄糖是糖酵解细胞代谢的燃料，研究者猜想GLUT1抑制的敏感性可能与每个细胞系的基础代谢状态相关。生物能量图谱揭示通过细胞外酸化速率(ECAR)和线粒体耗氧率(OCR)反映的基础糖酵解速率表示氧化磷酸化(OXPHOS),在BAY-876敏感vs耐药的TNBC细胞中有差别（图2a。）虽然耐药细胞系ECAR略有下降，但是OCR却高于敏感细胞系3倍（图2a）。从OCR到ECAR的比率(OCR/ECAR)表示高度依赖OXPHOS，在耐药的TNBC细胞系中水平也显著更高（图2b）。这一观察提示BAY-876耐药的细胞具有更高水平的OXPHOS。除了基础代谢生物能量图谱，乳腺癌细胞的亚群中也提示在有限葡萄糖的条件下从需氧糖酵解到OXPHOS的转变，例如在宫颈癌、胶质瘤以及胰腺癌细胞系中。这一代谢的可塑性说明在糖酵解和OXPHOS之间的相互作用，能够使细胞适用它们生物能量图谱到微环境的改变。与BAY-876抑制葡萄糖摄取一样，通过对ECAR（图2c、d）、葡萄糖摄取（图2e）以及乳酸分泌的测量，糖酵解的速率在GLUT1抑制后显著降低，无论是通过BAY-876处理还是敲除GLUT1。然而BAY-876-耐药的细胞在BAY-876处理或者敲除GLUT1导致GLUT1抑制后大约OCR双倍，但是在敏感的细胞系中并未观察到显著的不同（图2f、g）。这提示在BAY-876耐药的细胞系通过升高OXPHOS代谢图谱以弥补葡萄糖摄入的降低，因此能够维持细胞生长和存活。由于谷氨酰胺是驱动OXPHOS的主要能量来源，研究者接下来检测了敏感和耐药的TNBC细胞是否依赖于谷氨酰胺。BAY-876-耐药的TNBC细胞无论是SLC2A1敲除导致GLUT1缺失还是BAY-876处理的条件下都表现出谷氨酰胺缺失（图2h）。此外，将谷氨酰胺从生长培养基中移除后发现耐药TNBC细胞系对BAY-876的敏感性增加，提示，耐药细胞依赖以谷氨酰胺为燃料的OXPHOS以规避GLUT1抑制导致的生长抑制（图2j）。这些结果进一步说明BAY-876-耐药TNBC细胞适应生物能量图谱的能力以及在封闭GLUT1后代谢的需求。
图2 OXPHOS水平与GLUT1抑制应答相关
GLUT1能够影响许多生物学过程，然而这些是如何通过肿瘤细胞对GLUT1依赖发生的仍然不清楚。为了解决这一关键的问题，研究者首先从17个TNBC细胞系中利用IC50值检测了与BAY-876敏感性或者耐药性相关的分子和表型的特征（图1d）。在敏感和耐药细胞系中确定的高度可重复应答提示BAY-876处理和GLUT1抑制并不是普遍的细胞毒性。为了确定细胞内耐药的分子机制研究者考虑了一些候选的信号通路。由于BAY-876能够在高度耐药的细胞系中降低葡萄糖的摄入和糖酵解的速率（图2c、d），研究者排除了药物外流泵或者药物代谢机制受损可能导致的BAY-876有效浓度的降低。接下来，研究者在TNBC细胞系中检测了SLC2A1的mRNA和蛋白表达。对BAY-876的应答并不与SLC2A1的mRNA水平或者蛋白水平相关。随后研究者对所研究TNBC细胞系已发表的转录组数据进行系统的全局剖析。研究者在BAY-876应答者和非应答者之间绘制了差异表达的基因（图3a），并且将这些基因进行GSEA分析。在分析中与OXPHOS信号通路相关的基因组显著（图3b、c），提示图2中耐药细胞功能线粒体输出的升高是由于OXPHOS基因表达特征的升高。GSEA分析也说明在耐药vs敏感的细胞系中最显著富集的信号通路是E2F靶向信号通路（图3b），提示参与E2F靶向信号通路的基因表达升高与GLUT1抑制的耐药相关。为了进一步证实病人样本中的这种关联，研究者利用TCGA数据阵中TNBC肿瘤的转录组数据优势。基于TNBC细胞系中OXPHOS代谢升高与GLUT1抑制的耐药之间的强烈作用，研究者利用OXPHOS基因表达图谱的增多以区分BAY-876假定的耐药样本和假定的敏感样本。通过计算OXPHOS信号通路与其他基因表达图谱Pearson相关系数发现E2F靶向信号通路上存在很强的聚类，提示参与E2F靶向信号通路基因的高表达与原发性TNBC肿瘤样本中OXPHOS相关基因表达相关（图3c）。研究者接下来确定了与上述基因表达和代谢差异相关的蛋白特征，并且预测了TNBC细胞对BAY-876的相对应答能力。利用蛋白组学数据库对研究者的12个TNBC细胞系进行分析，确定了8个差异表达的蛋白，与BAY-876应答显著相关（图3d）。在耐药细胞系中富集的大多数蛋白（3/5）是E2F靶向信号通路的成分，命名为CDKN2A、CCNE1、CHK2。这三个蛋白在BAY-876敏感的细胞系中水平升高，位于第一的是眼癌转录抑制蛋白RB1，作为一个上游的转录因子减弱已知的E2F靶基因的表达。研究者进一步证实RB1蛋白水平与BAY-876的敏感性相关（图3e）。研究者也通过免疫印迹对17个TNBC细胞系的RB1蛋白水平进行评估（图3f）。这进一步证实RB1蛋白水平与BAY-876的敏感性之间显著相关（图3g）。这些结果提示RB1的蛋白水平升高导致了对BAY-876处理的敏感性，而RB1蛋白的低水平与TNBC中BAY-876的耐药性相关。为了验证这一概念，研究者在两个BAY-876-耐药的细胞系MDA-MB-436和MDA-MB-468中过表达RB1（图3h）。在两个细胞系中RB1的过表达导致ECAR/OCR的比率升高并且使细胞对BAY-876处理显著敏感（图3I、j）。相反，在BAY-876敏感的TNBC细胞系中敲除RB1导致OCR/ECAR的比率更高，并且使细胞难以抵抗BAY-876抗增殖的效应（图3k-m）。为了检测RB1依赖代谢功能的潜在机制，研究者在HCC1806系中敲除或者未敲除RB1对OXPHOS基因表达进行评估。RT-PCR结果观察到shRNA介导的RB1沉默导致参与OXPHOS的线粒体基因表达，这与近期的报道在乳腺癌中RB1缺失导致线粒体蛋白翻译并且提高OXPHOS一致。研究者的结果提示RB1蛋白的水平可作为TNBC细胞接受BAY-876处理后应答的生物标记物。
图3 RB1蛋白水平区分GLUT1抑制应答
为了更好的解释这一假说的临床相关性，研究者在一组TNBC病人来源的样本中检测了RB1蛋白水平与BAY-876敏感性之间的关系。PDX来源的类器官(PDXDOs)被认为能够更好的总结乳腺组织学和上皮异质性的特点，因此被应用于评估肿瘤治疗中药物反应。因此，从三个不同TNBC病人中获得的PDXDOs进行培养，其中两个RB1的水平很低，一个表达RB1（图3n）。与研究者在TNBC细胞系中观察到的抑制，在PDXDOs中RB1的高表达指示对BAY-876的敏感性（图3o）。一些RB1表达低的PDXDOs (PDXDO-B64和PDXDO-1963)对BAY-876处理仅有微弱的部分反应。研究者猜想这可能是由于细胞亚群中RB1表达的异质性造成的。同样，RB1的免疫染色也提示尽管在PDXDO-B64中大多数细胞都是RB1阴性的，一些细胞却有很强的RB1染色信号，证实这是一个复合型的群体，对BAY-876的应答表现出RB1相关的差异性。研究者进一步在PDXDEs中检测了GLUT1抑制的有效性以及与RB1蛋白表达的相关性（图4a）。与肿瘤产生的类器官的培养——将细胞切碎并酶解成游离细胞不同，PDXDEs在原生形式中培养，因此保留了他们原始病人特异性的3D结构和肿瘤微环境。以这种方式，这些模型比PDX模型更加类似，同时也规避了相关的成本和时间。PDXDE版式与细胞系相比具有其他的优势，类器官和PDX模型，如它的高吸收率与肿瘤的侵袭性无关以及在生理3D结构内培养肿瘤样本的能力。因此在乳腺和其他肿瘤中PDXDEs能够准确的预测体内对多种药物或者模拟物病人特异的应答。PDXDE模型的一个重要优势是用于评估具有次优药理特性的成分，在体内小鼠研究中限制最大剂量或者可能安全实现的暴露，例如化学探针BAY-876。研究者首先建立了维持TNBC PDXDEs培养的合适条件。通过H&E染色说明在明胶海绵上培养48小时后PDXDEs的组织框架和形态，与原始肿瘤组织是一致的（图4b）。肿瘤细胞在周围的基质中出现，说明维持了PDX模型。外植体的增殖能力利用免疫组织化学标记ki67进行评估，25%或以上的变化被认为是显著的应答。在匹配的组织培养T = 0 h和48 h之间ki67阳性细胞核数量无明显变化（图4c）。此外，对凋亡标记物CIC3的免疫组化结果显示在培养超过48小时的PDXDEs中并没有观察到凋亡细胞的比例显著变化（图4d）。总之研究者的结果说明PDXDEs在超过48h的时间段中是可行的。接下来研究者在6个不同病人的PDXDEs中通过RB1的免疫组化对RB1的蛋白水平进行定量。每个PDXDE被标记为0（<10%的细胞被阳性染色）,1（>10%且<50%的细胞被阳性染色）,2（>50%的细胞被阳性染色），分别代表RB1阴性、中间物、阳性的PDXDEs。RB1阳性的外植体(PDXDE-1)和RB1阴性的外植体(PDXDE-2)随后被用于评估GLUT1抑制的效果。这些PDXDEs的每一个都表达相似水平的GLUT1。在两个PDXDEs 中RB1和GLUT1的表达水平通过免疫印迹得到证实（图4e、f）。与研究者细胞系和PDXDO结果一致的是，通过对Ki67染色，BAY-876 (3 μM)处理消除了70%(7/10) PDXDE-1 RB1阳性外植体的增殖（图4g）。尽管在这些外植体中观察到对BAY-876应答的肿瘤间异质性，PDXDE-1外植体在BAY-876处理后ki67的增殖(p < 0.01)显著降低（图4i）。cleaved caspase-3染色也发现在BAY-876处理的PDXDE-1中凋亡的显著升高（图4j）。相反在RB1阴性的PDXDE-2外植体内在BAY-876处理后细胞增殖或者凋亡的标记物并未显著改变（图4h、k、l）。最终演技组和利用同时表达RB1和GLUT1的TNBC病人来源的PDX模型对BAY-876的抗肿瘤效果进行评估（图4m）。带有100mm3肿瘤的动物被随机分为两组，分别口服对照或者BAY-876。利用2 mg-kg的 BAY-876处理每天一次，处理30天，肿瘤的生长受损但是体重并未显著减低（图4n、o）。在处理30天后BAY-876处理小鼠肿瘤的体重显著低于对照小鼠（图4p）。总之在一系列临床前PDX来源模型中研究者的结果为基于RB1蛋白的表达水平特异性抑制GLUT1作为TNBC治疗的策略提供了合理的解释，为今后TNBC病人治疗中抑制GLUT1提供了依据。
图4 RB1水平支配了病人样本中BAY-876 的敏感性
在本研究中，研究者系统评估了TNBC细胞系对GLUT1抑制的脆弱点。随后研究者确定了GLUT1依赖的分子机制并且在病人来源的类器官和肿瘤移植体中得到验证。最终研究者证实RB1蛋白可作为GLUT1敏感性的预测性的生物标记物，并且可能潜在的应用于靶向GLUT1治疗TNBC病人的分级。
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