科研 | Immunity：人类和小鼠肺癌的单细胞转录组学揭示了个体和物种间保存的髓样细胞群（IF=21.522）
论文ID
原名：Single-Cell Transcriptomics of Human and Mouse Lung Cancers Reveals Conserved Myeloid Populations across Individuals and Species
译名：人类和小鼠肺癌的单细胞转录组学揭示了在个体和物种间保守的髓细胞群
期刊：Immunity（一区）
IF：21.522
发表时间：2019年5月
通讯作者：Virginia Savova，Mikael J. Pittet，Allon M. Klein
通讯作者单位：哈佛医学院系统生物学系，麻省总医院研究所和哈佛医学院系统生物学中心
实验设计
结果
人和小鼠肺癌中免疫细胞基因表达的scRNA-seq图谱
研究者在人类NSCLC（非小细胞肺癌）和小鼠肺腺癌（LA）模型中定义TIM细胞亚群，并建立这两种生物之间的相似性和差异性（图1A）。首先从接受两种NSCLC类型之一切除的7名人类患者中获得了新鲜的肿瘤组织：LA（7人中的5人）和鳞状细胞癌（SCC）（7人中的2人）。这些样本来自尚未接受癌症治疗的患者，只有一位例外，患者年龄61～83岁。肿瘤具有不同的肿瘤分期，分为女性（n = 4）和男性（n = 3）受试者。活检组织经inDrop-scRNA seq平台分离、清洗和快速处理。在过滤了scRNA序列数据以排除假定的双重态细胞和应激或死亡细胞后，总共7名患者的40362个的细胞转录本被保留下来进行分析。这些数据通过SPRING进行可视化分析（图1B）。在所有细胞中，15%（n=5912）被分为成纤维细胞、内皮细胞、红细胞和上皮细胞类型。图1A分析了这些非免疫细胞的群体结构，这些细胞上的数据可供进一步探索。其余的研究集中在免疫细胞上（图1C）（n=34450）。
通过对健康小鼠和荷瘤小鼠免疫细胞的scRNA序列分析，获得了一个配对的数据集（图1D）。为了诱发LA肿瘤，小鼠被注射了KP1.9肿瘤细胞系。研究者分离并测序了来自健康（即无瘤）和荷瘤小鼠（两个小鼠）肺中的约17000个CD45+单细胞，排除线粒体高负荷（细胞死亡指标）和假定的双重态细胞后，保留15939个单细胞转录体进行分析，并通过SPRING进行可视化（图1D）。
人类和小鼠的免疫细胞都划分为几个主要的细胞簇，其中一些具有复杂的内部结构，而次要的簇则占细胞总数的不到1％。为了定义细胞的身份，作者应用了贝叶斯分类器，将每个单细胞转录组分配给先前注释的转录状态（图1C、1D）。对于人类细胞注释，研究者使用了FACS分类亚群的整个转录组图谱。对于小鼠，使用了来自IMMGEN consortium的可比数据集。分类结果显示，这些簇几乎与所有已知的主要免疫细胞谱系一致。在人类中，鉴定了各种髓细胞（肥大细胞、中性粒细胞、典型的树突状细胞、浆细胞样树突状细胞、单核细胞和巨噬细胞）和淋巴细胞（T细胞、自然杀伤细胞、B细胞和浆细胞）。在小鼠中，除了血浆和肥大细胞外，研究者还鉴定出了相同的谱系。检测到嗜碱性粒细胞，这在人体活检中是看不到的。在这两种生物中，分类器都没有将一个不同的细胞簇识别为嗜酸性粒细胞，这表明这些细胞不代表一个不同的细胞状态，极为罕见，或未能在样品制备过程中存活。人类和小鼠的主要免疫亚群的基因表达如图1E和1F所示。
关于收集这些数据，作者作了两个技术说明。首先，中性粒细胞的转录物计数非常低，因此需要设置较低的过滤阈值才能进行检测。使用scRNA-seq研究中常用的数据过滤器时，可能会无意中排除这些细胞。其次，患者肿瘤中的浆细胞对PTPRC （编码抗原CD45的基因）表达的转录物计数非常低。这可能解释了为什么在CD45分类的小鼠免疫库中未检测到浆细胞。
研究者将通过scRNA-seq鉴定的细胞类型的丰度与用于小鼠组织流式细胞分析的常规门（conventional gates）进行了比较。结果表明两种方法之间的定量一致性很强（图1 G）（p <10 -5，Pearson R = 0.98）。作者观察到，七名患者中有六名代表了所有八种主要细胞类型（图1 H，I），其比例不同可能反映了疾病病因或进展的差异。这些发现表明，该患者队列代表了肺肿瘤免疫微环境的主要方面。
图1：非小细胞肺癌小鼠和人类免疫细胞的单细胞转录谱。
（A）确定并比较两种肺癌免疫转录状态的实验工作流程示意图。从患者肺肿瘤活检（n=7）、小鼠肺肿瘤（n=2）和小鼠健康肺组织（n=2）制备单细胞悬液。
（B）肺肿瘤活检中免疫和非免疫单细胞转录本（n=40362）的二维可视化（n=7）。
（C和D），来自（C）人类患者（34450个细胞）和（D）小鼠（15939个细胞）的肺免疫细胞的SPRING plots图。主要细胞类型由Bayesian细胞分类器定义，该分类器具有FACS分类细胞群体的整体转录组轮廓。
（E和F），人（E）和（F）小鼠免疫细胞中具有代表性的免疫细胞型富集基因的单细胞基因表达。
（G）流式细胞术测定的小鼠免疫细胞频率与满足相同门控方案的scRNA-seq簇的比较。
（H）检测到的免疫细胞类型数量与患者数量的累积图。
（I）通过绘制每个患者免疫细胞类型分布图显示患者间异质性。
人类和小鼠免疫细胞的无偏比较揭示了主要基因表达过程的广泛保守性
研究者根据细胞类型对小鼠和人类肿瘤中免疫细胞的基因表达状态进行了研究。总计超过4896个基因在主要细胞中的表达有显著差异。在小鼠中的表达有相当数量（4545）(图2A和2B)。尽管这里定义的每种免疫细胞类型都包含进一步的亚结构分类，但在经典细胞类型水平上定义的基因表达谱反映了许多已知的标记（图2A和2B）。
为了系统地比较人类和小鼠的免疫细胞，研究者量化了人类和小鼠免疫细胞类型的平均转录组之间的相似性。这种“低分辨率”分析忽略了每个谱系中的子结构，并作为每个谱系中详细分析的起点。作者观察到，细胞类型的一致性决定了基因表达谱之间的相似性，而不是源生物。这可以通过对细胞类型的基因表达（相关距离）进行聚类（图2C）和对两种细胞类型中细胞类型特异基因的表达（图2D）来观察。除T细胞和NK细胞外，每一个主要细胞系都与其同源基因聚在一起。T和NK细胞在生物体内死亡，反映了它们在SPRING可视化（图1C和1D）和表达热图（图2D）中观察到的基因表达接近。基因表达的相似性也反映了个体发育，骨髓细胞与淋巴细胞分离。pDC是一个明显的例外，pDC被认为是髓样细胞类型，但此处与淋巴谱系有关。此结果与最近的研究结果一致，即pDC与常规DC有所不同。
这种细胞型同源物的对应关系再次证实了人与小鼠之间存在保守的免疫过程，并且它合理地检验了每个免疫谱系中的相似性和差异性。
图2：免疫细胞类型显示小鼠和人类之间在主要谱系（A and B）水平上的同源基因表达富集于（A）人类和（B）小鼠样本中的主要免疫细胞类型。（C）主要细胞谱系的层次聚类按细胞类型对细胞进行分组。细胞类型标签如图1C和1D所示；使用基因表达相关性对细胞类型进行聚类。（D）热图显示在小鼠和人类免疫细胞类型中类似富集的基因同源基因。
小鼠和人类肺部肿瘤含有常见的和不同的中性粒细胞亚群
研究者分析了每个主要集群的亚结构，重点是中性粒细胞、树突状细胞、单核细胞和巨噬细胞（T、NK、肥大和浆细胞亚状态）。并提供了中性粒细胞的数据，这些数据展示了小鼠和人类之间保守和发散的基因表达模式。
在病人的肿瘤样本中，中性粒细胞形成一个连续的状态，通过谱聚类分解成五个子集(human N1–5or hN1–5) (图3A–3C)。这些子集在患者中的表现形式各不相同（图3D、3E）。小鼠KP1.9肿瘤中的中性粒细胞也形成一个连续的状态，它分解成六个亚群（小鼠N1–6或mN1–6）（图3F–3H）。这些亚群在无瘤肺和含瘤肺中的比例有显著差异：mN1和mN2在健康肺中约10倍，mN4和mN5是在肿瘤组织增加10-20倍，mN3和mN6仅存在于肿瘤组织中（图3I）。
研究者先前鉴定了两个小鼠肺中性粒细胞亚群，其特征是唾液酸结合免疫球蛋白样凝集素F（SiglecF）的可变表达。SiglecFlow细胞存在于无肿瘤的肺中，而SiglecFhigh在肿瘤组织中积聚并表现出多种促肿瘤功能。本研究发现三个中性粒细胞亚群（mN4-6）表达Siglecf，并且这些亚群确实是高度肿瘤富集的，而其余三个亚群（mN1-3）是SiglecFlow。
为了验证观察到的亚群体结构，研究者将来自肺组织的SiglecFhigh与siglecFlow分类（图S3D），并通过qPCR检查预测的基因表达标记。研究者假设这种排序策略会使mN4-6簇中的细胞比mN1-3簇中的细胞更丰富，并且确实证实了在SiglecFhigh细胞中Car4、Clec4n、Clec5a、Csf1、Ltc4s、Nt5e、Runx1、Siglecf、Spp1、Vegfa和Xbp1转录物的预测过表达（图S3E-S3G）。作者通过流式细胞术进一步分析Nt5e和Clec5a蛋白的表达，发现mRNA和蛋白基因表达模式之间有很强的对应关系（见原文补充图3）。
为了确定中性粒细胞亚群在物种间的相互关系，研究者在单细胞和整个转录组水平上系统地比较了人类和小鼠中性粒细胞（图2C，D）。发现物种之间中性粒细胞种群结构的几个方面是保守的，这可以通过无监督的比较来理解（图3J-3L）。在人类和小鼠中，研究者观察到中性粒细胞亚群从N1到N3和N4，再到N5的共同顺序。hn1和mn1表达大量典型的中性粒细胞标志物（MMP8和MMP9，S100A8和S100A9，以及ADAM8，而hn5和mn5表达细胞因子CCL3和CSF1，以及CSTB、CTSB和IRAK2（图3B，G），并且在小鼠中具有肿瘤特异性。mn6中性粒细胞与mn4分子最为密切相关（例如，它们都表达Hexb和Ptma），尽管mn6唯一表达Fcnb和Ngp（图3G）。在这两种生物中，hn2和mN2中性粒细胞除了连续的状态之外，形成了一个亚群体；这些细胞很少见，但具有很强的转录特征，表达I型干扰素应答基因，包括IFIT1、IRF7，RSAD2（前50个标记基因在基因个体学（GO）术语“细胞对I型干扰素的反应”中表现丰富。研究者在小鼠健康肺组织和肿瘤肺组织中都发现了N2细胞，在患者的外周血中也有出现。
总之，研究确定了小鼠和人类中性粒细胞中，中性粒细胞基因表达的三个保守模块（图3l）：（1）中性粒细胞表达典型的中性粒细胞标志物（hn1和mN1）；这些进展持续到（2）中性粒细胞状态，即肿瘤特异性和促进小鼠肿瘤生长（hn5和mn5）；（3）中性粒细胞亚群，具有I型干扰素应答（hN2和mN2）的表达特征。
图3：人和小鼠肺肿瘤包含中性粒细胞表型的保守轴和显示I型干扰素应答的中性粒细胞亚群。
（A）–（E）中定义的肺中性粒细胞亚群来自人类患者肿瘤。
（F）–（I）中定义的肺中性粒细胞亚群来自小鼠肿瘤和健康组织。
树突状细胞包含四个不同的亚群，在小鼠和人类之间是保守的
使用相同的贝叶斯分类器和参考数据集，研究者将剩余的TIM群体指定为具有单核细胞、巨噬细胞和dc的基因表达谱。分别分析了每一个子集。患者肿瘤树突状细胞的谱聚类确定了四个亚群：pDC（人类pDC或hpDC）和hDC1-3，它们在数十个基因中显示出不同的基因表达过程（图4A-4C）。7名患者中有6名存在DC亚群，尽管比例不定；1名患者存在多个亚群，可能是由于该样本中细胞数较低（图4D、4E）。
为了评估hDC1-3，将其基因表达谱与包括CDC1（流式细胞术定义为XCR1+CADM1+）和CDC2（CD1A+CD172A+）的大容量分类经典DC的基因表达谱进行了比较。CDC1是CD8+T细胞的有效抗原交叉呈递物，而CDC2优先与CD4+T细胞相互作用。hDC1和hDC2亚群表达的基因特征很好地映射到这些DC群体（图4F）。因此，hDC1s唯一表达cDC1标记XCR1、CLEC9A、TBHD（编码细胞表面蛋白CD141的基因）和CADM1，而hDC2表达cDC2标记，包括CD1A、CD1C、CD1E、CD207（编码胰岛蛋白）和FCER1A（图4B）。
根据与先前公布的体外脂多糖（LPS）刺激的树突状细胞微阵列数据集（图4G）的比较，hDC3显示出“激活”的树突状细胞表型，但缺乏关键的cDC1、cDC2和pDC基因的表达。例如，hDC3表达cDC1相关基因BATF3和IRF8，但既不表达XCR1也不表达CLEC9A（图4H）。单个hDC3细胞也无法与单个DC特征一致地关联（图4I）。然而，许多与hDC1相似，hdc3在DCs中的表达比单核细胞或巨噬细胞更接近。
在小鼠（图4J-4O）中，作者再次发现四个不同的DC亚群，所有这些亚群在荷瘤肺中都显著增加（图4M）。这四个亚群可能与人类中发现的一个基因相关，首先检查每个细胞簇的标记基因（图4K和4L），然后使用直系可变基因进行无监督的层次聚类（图4P-4R）。mDC1–3镜像hDC1–3，而MPDC镜像HPDC。
mDC1和mDC3的基因表达谱分别类似于那些确定了CCR7-和CCR7+在小鼠胸腺和外周的的淋巴结cDC1亚群。这些数据表明，Ccr7- mDC1可以产生Ccr7+ mDC3细胞。mDC3也类似于肿瘤浸润的Ccr7+分泌白介素12并具有抗肿瘤活性的 DC。CCR7的表达可能使mDC3迁移至引流淋巴结，但其中一些细胞可以保留在肿瘤内。
总之，小鼠和人类树突状细胞群体的保守结构及其在其他研究中的重现，支持树突状细胞可以在物种之间一致地分类和比较的观点。两种组织中的肿瘤都分解成浆细胞样和cDC1、cDC2亚群，并分解成静止和激活的DCs，无法识别其他的肿瘤。在这两种生物中，pDC似乎代表了不同的细胞状态，暗示了其他DC的替代个体发育。两种生物还呈现出显示DC样特征的单核细胞，如下所述。
图4：对树突状细胞的单细胞转录分析显示，在（A）–（I）中定义的小鼠和人类树突状细胞（DC）亚群之间保守的四个不同亚群来自人类患者，而在（J）–（O）中定义的亚群来自小鼠。
单核细胞亚群在小鼠和人类之间是非常保守的，而巨噬细胞亚群显示出物种特异性的模式
研究者定义了14种非人类细胞的转录状态，这些细胞被划分为单核细胞和巨噬细胞。显示了三个单核细胞（hMono1-3）、九个巨噬细胞（hMono1-9）、一个单核细胞和树突状细胞（hMonoDCs）的基因特征，还有一个以细胞周期基因表达（hMonoDCs）为特征（图5A-5D）。通过比较基因表达与注释的参考基因表达谱（图5D）的基因表达，将这些特性分配给这些簇。尽管谱聚类确定了相对大量的转录状态，但所有这些状态都可以在七分之四的患者中检测到（图5C）。这些结果表明，由多基因表达程序定义的肺肿瘤中存在大量单核细胞和巨噬细胞异质性，可在个体间重复。
检测基因特征以评估观察到的状态是否与分别用于定义抗炎和促炎巨噬细胞的典型M1和M2状态相对应。在人类中，没有巨噬细胞簇仅表现出M1样表型，而hMø3、hMø6、hMø8和hMonoDCs表现出M2基因特征（图5E）。对于生长中的肿瘤中发现的巨噬细胞来说，M2信号的富集是可以预期的，但是这些数据表明M2不是一个明显的状态。
在小鼠中，研究者定义了八种转录状态，分别对应于单核细胞（monoo1-3）、巨噬细胞（mMø1-4）以及单核细胞和树突状细胞（图5F-5J）。单核细胞状态在健康的无肿瘤组织中有很好的代表性，单核细胞簇（mMø4）通过其Krt79、Krt19和Car4的表达被鉴定为常驻肺泡巨噬细胞。剩余的小鼠巨噬细胞状态是强肿瘤富集（图5H）与人类一样，作者使用带注释的参考基因表达谱（图5I）来分配集群身份。与人类数据相似，作者发现先前注释的M0、M1和M2基因表达特征与小鼠巨噬细胞簇没有明显关联，并且所有巨噬细胞都表现出M2样表型（图5J）。
这些种群的复杂性使得通过单独检查发现生物体间的种群结构相似性是一个挑战。然而，一个系统的无偏比较（图5K和5L）发现hMono1-3分别对应于MONO1-3，并且每个种群都有不同的基因表达模式。单核细胞亚群在患者和小鼠肿瘤中同样相似，其特征是DC相关基因的高基因表达，包括CLEC10A、MHC II类基因和相关基因（如CD74）（图5B、5G、5K和5L）。人类和小鼠的单核细胞亚群都不同于DC群体DC1–3和pDC（例如，人单核细胞缺乏或表达少量的DC标记，如XCR1、CD1A、CD1E、FSCN1和TCF4）。
上述对应关系反映了单核细胞亚群之间的典型区别，以及一种不太受重视的单核细胞状态。人类和小鼠中都有两种单核细胞，尽管它们的标记不同。在人类中，这些在血液中被识别为CD14+（所谓的“经典”）和CD14intCD16+（“非经典”）。小鼠相应的个体和功能相关亚群被定义为Ly6ChighCCR2+CX3CR1int和Ly6C low CCR2 - CX 3 CR1 高表达的Ly6Chigh单核细胞可向组织中外渗，并产生巨噬细胞和树突状细胞，而Ly6C low 单核细胞可保留在血管系统和血管壁上。在小鼠数据中，MOMO1表达了Ly6Chigh单核细胞标记物Ly6c1、Ly6c2和Ccr2，而MOMO2表达了Ly6C low 单核细胞标记物Cx3cr1和Fcgr4。类似地，hMono1表达经典的单核细胞相关基因，包括CD14和FCN1，hMono2表达非经典标记CDKN1C，LILRB2和ITGAL。研究者对hMono和mMono子集的全基因组比较（图5 K和5L）证实了生物体之间经典和非经典单核细胞类型的对应性。
图5：单核细胞亚群在小鼠和人类之间具有良好的保守性，而巨噬细胞亚群具有种间异质性。（A）–（E）中定义的单核细胞（Mono）和巨噬细胞（Mø）亚群来自人类患者，而（F）–（J）中定义的亚群来自小鼠。
在所有单核细胞和巨噬细胞中，hmono3和mmono3独特地表达了一组中性粒细胞相关基因（图5B、5D、5G和5I），包括S100A8、S100A9和CSF3R。在人类中，hmono3也表达CD14+CD16-单核细胞表明该群体可能是“经典”单核细胞的一个未被重视的亚型。在小鼠中mMono3没有表达清晰的Ly6Chigh或Ly6Clow基因标记。相反，该簇同时包含Ly6Chigh或Ly6Clow样细胞。因此，在小鼠中，与中性粒细胞相关的基因定义了一个与经典和非经典身份正交的程序是可能的。先前在外周血中鉴定出第四单核细胞亚群。由该子集表达的许多基因在本研究的任何单核细胞和其他种群中均不存在，作者怀疑该子集可能包括与NK细胞形成的实体双态。
小鼠和人的巨噬细胞表现出保守和分化的表型。在这两种生物中，关键的巨噬细胞相关基因，如MRC1andAPoE、补体基因（C1QA、C1QB和C1QC）和组织蛋白酶（CTSB和CTSD）与其他TIM相比在巨噬细胞中富集，并在连续梯度的簇间广泛表达。小鼠巨噬细胞亚群的基因特征是否在人类巨噬细胞簇中发生变化（图5M），发现mmø1和mmø2的基因特征分别出现在人类巨噬细胞亚群的梯度上，特别是hMø8和hMø9和hMø3–5亚群。同样，mMø4（肺泡巨噬细胞）基因特征主要定位于hMø7。相比之下，mMø3基因的特征没有很好地映射到人类巨噬细胞亚群，这暗示了小鼠肿瘤特有的亚群。相反，hMø1和hMø2did似乎没有很好地被小鼠巨噬细胞所代表。这些复杂的关系加强了物种间巨噬细胞亚群联系的难度。然而，本研究分析提供了证据，证明在小鼠和人类之间广泛区分肿瘤相关巨噬细胞和单核细胞的转录程序是非常保守的，并且不同的小鼠肿瘤浸润巨噬细胞亚群的特征可能对应于患者肿瘤中的几个细胞亚群。研究者总结了图5N中的主要相同点和不同点。
在人类巨噬细胞亚群中，确定了不同的趋化因子表达，包括表达中性粒细胞趋化因子CXCL5、表达CXCR4配体CXCL12的hMø8和表达T细胞募集趋化因子CXCL9、CXCL10和CXCL11的hMø9。这些巨噬细胞表达趋化因子的受体在其他免疫细胞类型中显示出异质性表达模式。例如，编码CXCL5受体的CXCR2仅由中性粒细胞表达，而编码CXCL9、CXCL10和CXCL11受体的CXCR3主要由T细胞、NK细胞和pDC表达。在小鼠中，作者没有观察到相同的模式；相反，小鼠mMø（尤其是mMø1和mMø3）主要表达单核细胞和中性粒细胞趋化剂，而表达可忽略的T细胞趋化因子CXCL9、CXCL10和CXCL11。这些发现表明，巨噬细胞的多样性可能部分是由它们的迁移线索指向具有不同趋化因子受体表达的细胞群来解释的。
TIM亚群不同标记基因的定义及其与患者生存的关系
在检查非免疫增殖上皮细胞状态（可能包括样本内的肿瘤细胞）（图6A）时，作者发现每个患者都表现出不同的细胞状态，这表明样本大小不足以评价患者上皮表型的多样性。相比之下，患者之间的TIM状态重叠（图6B）。
患者间TIM状态的重叠促使作者通过检测生存研究中每个亚群的基因表达来评估他们与患者生存的关系。为此，将所有肿瘤相关细胞（非免疫细胞和免疫细胞）纳入统计。一些特定的基因显示出与患者生存有明显的关联：例如，HN2标记物是G15，hN5标记物PI3与患者生存呈负相关，而HDC2标记物CD207则与患者生存呈正相关（图6d），127名患者通过PRECOG（图6E），并在图6F中总结了由此产生的关联性。该分析证实，富含CD8+T细胞和B细胞亚群的基因与更好的患者生存率一致，如预期的那样（图6E和6F）。对于一些亚群，没有一个基因表达具有足够的特异性，可以直接将其表达与群体丰富度联系起来（图6E）。在中性粒细胞、树突状细胞、单核细胞和巨噬细胞群中，许多亚群显示出特定的基因表达，这为每个亚群的预后关联提供了非常一致的观点。中性粒细胞亚群HN2和hN5都显示出与患者生存率低下相关的大量标记基因，hMø1和hMø9也是如此，而在髓系细胞中，HDC2显示出与生存率最一致的正相关；其他DC亚群和肥大细胞亚群也显示出正相关。这些结果支持先前的关联研究的发现，并将其扩展到每个主要细胞系中的亚群的解析。
获得标记基因（图6C和6E）允许开发新策略来检测组织切片中的免疫细胞亚群，为将来的大规模细胞分析提供机会，例如，使用现有的患者样本库。作者通过检测HN5中性粒细胞的标记物来检验这种分析的可行性。该亚群呈中性粒细胞状态的内营养持续期（图3A），与阴性患者生存率关系最密切，在小鼠和人类之间是保守的。在患者队列中，发现两名患者（Pt3和Pt7）的Hn5细胞丰度存在极大差异；其中Pt3细胞很少，而Pt7细胞较多（图6G）。正如所预测的那样，Pt7含有大量的PI3+细胞，而Pt3几乎没有（图6H）。两名患者的MPO +细胞数量均可检测到（图6 I），PI3+细胞的MPO+细胞数量（图6 J）。这些结果证实了scRNA-seq所看到的趋势，并证明了其在组织学研究设计中的实用性。
图6：TIM亚群的独特标记基因及其与患者生存的关系。
小鼠模型、免疫疗法和免疫表型对小鼠和患者肿瘤浸润免疫细胞的靶向基因
定义TIM图谱提供了一个机会，可以探究遗传试剂、药物和抗体如何针对小鼠和人类中不同的骨髓细胞群。对基因工程小鼠模型中的34个靶向基因进行了分类，例如，用于荧光细胞追踪、细胞消融或其他转基因表达的基因。作者还检测了26个编码免疫治疗剂靶向蛋白的基因和36个编码免疫表型用表面抗原的基因。对于每一个基因集，分别评估了小鼠和人类在免疫细胞中的基因表达一致性，以及特定的基因表达对定义的细胞类型的影响。尽管在基因工程小鼠模型和药物中靶向的许多基因在有机体之间的表达显示出良好的对应性，但也有显著的例外突出了物种间的差异。对于表面抗原，以及识别生物体之间的相似性和差异，值得注意的是，许多典型用于识别特定细胞类型的基因在多个细胞类型上都有表达。总的来说，这些结果强调了本研究中针对人类的特定小鼠免疫治疗模型的基准测试的必要性。这些发现也表明了用免疫细胞术来量化或纯化细胞类型的潜在缺点，这种方法可以将不同的细胞状态组合在一起。
肿瘤浸润仅部分与外周血状态重叠
探究了是否可以通过采集外周血（PB）来了解TIM细胞状态，外周血是一种更容易获得的组织样本，可用于诊断。作者开始通过将骨髓细胞状态与相同患者的PB骨髓细胞（六位患者）进行比较，来研究骨髓细胞状态的肿瘤特异性。目标是确定哪些肿瘤髓样状态具有循环对应物。
一些scRNA seq研究先前已经检查了血免疫人群，重点是PB 单核细胞（PBMC），这些细胞按其密度分类。PBMC制剂耗尽多形核细胞，包括所有的粒细胞，因此提供了不完整的髓样细胞视图。因此，作者用于通过红细胞耗竭进行分析的血液，以获得所有其他免疫细胞类型。过滤后，通过scRNA-seq收集了14411个细胞转录组。
所有患者中PB细胞和肿瘤细胞的SPRING嵌入揭示了少数肿瘤和PB免疫细胞处于重叠状态，尽管大多数没有重叠（图7 A）。因为所有患者样品在血液和肿瘤簇内重叠，这种分离未反映出文库批次的影响。PB细胞在转录上与肿瘤细胞可分离，但仍可反映特定的肿瘤细胞状态。应用细胞类型分类器（如图1 C所示），确定了预期的血液白细胞阵列，包括单核细胞，嗜中性白细胞，pDC，T，NK和B细胞（图7B）。这些血液人群的平均基因表达谱作为资源提供在表S2和图S7A。两种组织之间每种细胞类型的比例不同，并且仅在肿瘤中检测到一些种群。
探究肿瘤和血液组织中的髓细胞亚群是否相似。PB单核细胞群体聚类显示三种单核细胞状态（hbMono1-3）和一种单核细胞样状态表达伴随的树突状细胞相关基因（hbMonoDC）（图7C）。PB中性粒细胞形成一个连续体，通过谱聚类（图7D）将其分为六个子集（hbN1-6）。对于单核细胞，分层聚类显示肿瘤和血液种群之间的一对一匹配（图7E和7F），尽管肿瘤和血液单核细胞群共享的标记基因很少。考虑到单核细胞被定义为循环细胞，这一对应关系的一部分是预期的。然而，血液和肿瘤单核细胞不同（412个基因在5%FDR下差异表达2倍以上）（图7G）。例如，PB单核细胞表达的趋化因子受体CCR2的转录物明显增多，而肿瘤单核细胞表达的CXCL3是中性粒细胞表达的CXCR2受体的同源配体（图7H）。
在中性粒细胞中，血型亚群HBn2与肿瘤亚群Hn2高度对应，具有相似的I型干扰素特征（IFIT1、IFIT2、IFIT3和RSAD2），血型亚群hbN1、hbN3和HBn6与肿瘤簇Hn1和Hn3相关，并共同表达大量的典型中性粒细胞相关基因MMP9，S100A8、S100A9和S100A12（图7I和7J）。然而，与CCL3+肿瘤亚群hN5没有很强的对应关系。总的来说，血中性粒细胞和肿瘤中性粒细胞在基因表达上有很大的差异（图7K）。例如，肿瘤中性粒细胞表达的细胞因子CXCL8和IL17受体IL17RA的数量远远高于血液中的相应细胞（图7L）。
PB细胞还含有hbN6中性粒细胞，在肿瘤中未被发现或非常罕见（图7D和7I）。PB嗜中性粒细胞显示出在肿瘤中发现的种群结构的某些反映，但是肿瘤和PB都具有不重叠和未认识的嗜中性粒细胞亚群。得出的结论是，要了解TIM，必须直接评估肿瘤组织，因为PB不能概括肿瘤髓细胞的情况。
图7：肿瘤浸润仅部分与外周血状态重叠。
讨论
本研究通过scRNA-seq比较了小鼠和人之间的TIM种群结构，该序列无偏向预先定义的标志物和细胞状态的概念。在此过程中，作者定义了每种生物中的TIM转录态势，揭示了已知的和未认识的但可再现的TIM表型。在讨论这项工作时，研究者从其局限性开始，然后是关于全基因组水平TIM异质性的发现。肿瘤与血液髓样细胞的独特性；以及患者之间和生物体之间TIM表型的可重复性和保守性。
局限性：首先，对更多患者进行分析可能会发现其他TIM子集。中性粒细胞可能就是这种情况，因为要鉴定此处报道的所有五种亚型都需要七名患者中的六名。相比之下，四个DC和14个单核细胞和巨噬细胞子集都由三名患者代表，表明人肺TIM的组成成分很复杂，但是却很保守。此外，在所有患者中甚至检测到罕见的亚群。例如，hDC3子集占所有细胞的0.25％，但可重复发现。其次，分析更多单元可以进一步完善TIM异质性。尽管如此，作者分析了足够多的细胞以至少98％的置信度在至少3名患者中检测到至少0.05％的TIM状态，总共至少10个细胞。因此，作者认为本研究涵盖了主要的TIM转录过程。最后，与小鼠相比，使用了一种LA模型系统。因此，在小鼠和人类之间存在差异的地方，尚不清楚这些差异是否是由于物种特异性差异引起的。然而，物种之间的共通程度相当可观，并证明了使用动物模型研究各种TIM状态的相关性。另外，这里开发的方法可以重复用于其他小鼠模型，这将有助于选择和/或证明关于人类生物学的未来模型。
本研究有助于阐明TIM的异质性。首先，作者看到TIM异质性的一致性。无监督的聚类揭示了一个易于理解的环境，每种髓样细胞类型都显示了几个不同或形成简单连续体的定型基因表达过程。此外，尽管患者在每种细胞状态下显示出不同比例的TIM，但状态数仍然有限。这与来自同一患者的肿瘤细胞形成鲜明对比，后者是患者特异性的。得出的结论是，研究可能对常见的TIM基因表达程序有了完整的描述。特别是对于中性粒细胞，hN2和mN2 I型干扰素在人和小鼠中，应答信号均与从hN1和mN1到肿瘤特异性hN5和mN5的连续状态不同。即使对于表现出最复杂的表型和患者之间最大变异性的巨噬细胞，人类和小鼠巨噬细胞也表达了许多相同的基因，尽管存在不同的组合。在DC，pDC和cDC 1-3中应该代表组织DC的相当完整的描述。同样，单核细胞在人和小鼠中经常分解为经典和非经典子集，作者确实观察到这两个子集在生物体之间是一一对应的。但是，还观察到了以中性粒细胞或树突状细胞基因表达为特征的两个单核细胞亚群。这些单核细胞状态在小鼠和人类肿瘤以及血液样本中独立出现。
其次，研究发现血液髓样细胞不能很好地反映TIM状态。作者探究了TIM细胞的复杂性是否反映在血液髓样细胞群中，这将为诊断和临床研究的可获取性提供实际的优势。scRNA-seq对这个问题特别有价值，因为细胞表面标志物的表达通常会随着细胞离开血液而发生变化。从本研究中得出结论，血液只能提供有限的TIMs视图，并且还具有在肿瘤部位未见的骨髓细胞状态。这并不排除液体活检可以预测疾病的结果，但确实在血液髓样细胞状态与肿瘤部位的状态之间建立了较差的关系。
利用此处为多个细胞群体定义的群体结构和标记基因，将来可以测试不同子集与肿瘤进展的功能相关性；将细胞类型的丰度与人类和动物的临床结果和治疗反应相关联；并建立TIM子集与其对信号的依赖性之间的发展关系。TIM的人-鼠对应性的知识将在实现这些目标中发挥关键作用，而最终目的是深入了解髓样生物学和髓样免疫疗法。
评论
单细胞RNA测序（scRNA-seq）几乎可以在任何生物体中进行，允许跨物种进行无偏向比较。在这项研究中，研究者使用scRNA-seq分析了7例非小细胞肺癌（NSCLC）患者、该病小鼠模型和健康小鼠肺中的免疫群体。肺癌这种疾病非常普遍，而且现有的治疗方法往往难以治愈，并且这种组织在病人身上很难获得，这使得研究变得困难，并且需要可靠的小鼠模型。本研究的重点是小鼠作为人类TIMs模型的可能用途，但作者还将患者肿瘤中的免疫细胞与血液中的免疫细胞进行了比较。综合研究了荧光活化细胞分类（FACS）标记、转基因小鼠模型和人与小鼠亚群间的免疫治疗靶点的保守性。结果确定了TIM亚群的不同标记基因及其与患者生存的关系，所产生的资源可识别存在于大多数患者中的肿瘤相关的髓样细胞状态，在人类和小鼠中也是保守的。这一发现为利用已定义的TIM亚群作为诊断工具和治疗靶点并在小鼠中进行研究提供了机会。