科研|J. Crohn’s and Colitis：肠系膜脂肪细胞中由FADS2介导的脂肪酸去饱和紊乱有助于克罗恩病的慢性炎症
编译：琳儿，编辑：Emma、江舜尧。
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实验设计
1. 人体及细胞样本试验
实验人群为符合条件的CD患者（n=10）和非CD患者（n=10）。对于CD患者，从临近受累及的肥大肠系膜脂肪组织（htMAT）和健康段肠组织相邻肠系膜脂肪组织（nMAT）获得配对的样本。对于诊断为结肠癌并进行了右半结肠切除术的非CD病例，在距离癌病灶很远的地方获得回肠样本和正常对照组织（Control）邻近的MAT。UC患者的其他对照组也包括在内，以控制发现的特异性。
分离并培养肠系膜脂肪细胞。油红染色以评估胞内脂质积累和脂肪细胞纯度。之后，成熟的脂肪细胞经流式细胞CD45-CD34-CD36+门控方法评估数量。在3T3-L1细胞融合后培养2天，用胰岛素（5 µg/mL）、IBMX（500 µM）和地塞米松（0.1 µM）处理2天，促使细胞分化。将THP1细胞培养6小时暴露于185ng/ml的佛波醇12-十四酸酯13-乙酸酯，之后添加LPS或IL-4（20 ng/ml）共孵育48小时，从而诱导细胞分化（图1A）。为了确定FADS2在肠系膜脂肪细胞中调节脂质谱的作用，在非CD受试者的肠系膜脂肪细胞利用包裹了FADS2或FADS2-SiRNA的慢病毒载体进行瞬时转染。空载作为对照。利用核感染技术将慢病毒构建体转移至分化的脂肪细胞中。PPARR-α转染。利用FADS2过表达质粒和siRNA研究PPAR-α在3T3-L1脂肪细胞中调控FADS2表达的作用。
用对照病人和患有急性CD患者的肠系膜脂肪细胞进行体外转染试验。如图1A，第一，收集对照受试者分离的原代肠系膜脂肪细胞培养上清。用收集的培养上清刺激THP1细胞和从CD患者htMAT样本分离的脂肪细胞12h使细胞分化。第二，用lv-FADS2或siFADS2转染从急性CD病人分离的原代肠系膜脂肪细胞。收集THP1巨噬细胞通过流式细胞和RT-PCR分析验证极化状态。收集来自htMAT的原代肠系膜脂肪细胞以测量脂肪因子（脂联素，瘦素和抵抗素），细胞因子（IL-6, TNF-α），TLR-4/ NF-κb 途径和Erk-1/2途径的表达。
收集CD患者和非CD患者的肠系膜脂肪组织。分离的原代脂肪细胞和培养上清液分别收集。利用液相色谱-串联质谱（LC-MS）进行代谢组学分析。通过固相萃取从脂肪细胞条件培养基（ACM）中分离出脂肪介质。利用气相色谱对肠系膜脂肪细胞和脂肪细胞条件培养基ACM中的脂肪酸组成进行定量。
图1 细胞培养和处理
（A）脂肪细胞和THP1巨噬细胞的培养示意图。（B）原代肠系膜脂肪细胞分离，培养，油红O染色和流式细胞验证流程。（C）通过WB验证从对照和CD患者分离的原代脂肪细胞慢病毒转染验证。
2. 动物试验
（1）选择15周龄雄性C57BL/6 IL-10-/-小鼠建立自发性结肠炎模型。构建腺病毒，包含由CMV增强子和CBA启动子，FADS2和牛生长激素（bGH）poly-A两侧为AAV2反向末端重复序列组成的载体表达盒。将荧光素酶编码基因插入CBA启动子和FADS2序列之间的多克隆位点。向IL-10-/-和野生型小鼠腹腔注射150 µl FADS2腺病毒缓冲液，2周后进行荧光素酶成像。
（2）6-8周龄雌性BALB/c小鼠，TNBS诱导小鼠结肠炎。第0天，直肠内施用150 µl含有1%TNBS的50%乙醇。第7天用150 µl含有2.5%TNBS的50%诱导小鼠出现T细胞介导的炎症。所有小鼠饲喂AIN-93G基础饲料4周。α-亚麻酸（ALA）处理组灌胃ALA（30mg/kg 每3天）2周，而野生型和空白对照组灌胃相同体积的普通生理盐水。每周向TNBS处理小鼠腹腔注射0.05 mg/g选择性PPAR-α激动剂WY14643，以激活PPAR-α。合并治疗组，TNBS诱导小鼠经ALA先处理2周，并每周注射WY14643。第30天处死小鼠。
实验结果
1. CD患者肠系膜脂肪组织的代谢组学特征显示了不饱和脂肪酸生物合成的缺陷
对于人肠系膜脂肪组织样本的代谢谱，以热图的形式展示(图2A)，结果显示在CD患者的htMAT中观察到了不同的代谢谱。Figure2B-D总结了在不同比较间发生变化的代谢物。在htMAT上调的代谢物中，有几种亚麻酸，包括α-和β-亚麻酸，是多不饱和脂肪酸PUFAs（polyunsaturatedfatty acid）的前体。在下调的代谢物中，有几种类花生酸，如5(R)-HETE和resolvind2，这二者是长链PUFAs的衍生物。说明PUFA代谢发生了改变。基于PubChem数据库的对差异代谢物比对进行途径分析（图3）。对照和nMAT，对照和htMAT，nMAT和htMAT进行不饱和脂肪酸合成对比，通过气泡图发现不饱和脂肪酸代谢异常发生在CD患者的肠系膜脂肪细胞。不饱和脂肪酸代谢途径于图4A。几种必要的PUFAs，如花生四烯酸AA，二十碳五烯酸EPA和二十二碳六烯酸n-3系列多不饱和脂肪（ω-3多不饱和脂肪酸）DHA，来自饮食和亚麻酸（LA;18:2n6）、α-亚麻酸（ALA; 18:3n3）前体的伸长和去饱和。由于不饱和脂肪酸合成的改变，研究了对照及CD人群肠系膜脂肪组织的脂肪酸组成（表1）。在CD患者样本中发现ALA, LA, EPA, DHA的相对含量有所不同。FADS2催化ALA到EPA，EPA到DHA转化，活力与底物和产物的比例相关。结果显示三组的n-6/n-3 PUFAs比例相似。但与对照人群相比，CD患者的ALA:EPA, ALA:DHA和EPA:DHA比例显著下调，说明在CD-MAT中FADS2活性下降。
2. 在CD患者慢性炎症期间，定位于脂肪细胞的肠系膜脂肪组织中的FADS2下调
为研究PUFA的生成，研究分析了三个与PUFA合成相关的酶，FADS1,FADS2和伸长基因的表达情况。与对照样本和nMAT样本对比发现，CD患者的htMAT中FADS2表达显著下调（图4B）。DAPI和FADS2共染发现，FADS2蛋白首先定位于脂肪细胞膜（图4C）。免疫染色和WB也证明FADS2出现减少（图4D, F）。根据克罗恩病肠系膜脂肪细胞的促炎情况，研究假设在这些病人中肠系膜脂肪促进炎症的产生。
3. 肠系膜脂肪细胞中FADS2过表达改变了巨噬细胞的极化并加重了炎症反应
为验证FADS2在人的肠系膜脂肪细胞中的作用，利用FADS2和FADS2-siRNA慢病毒载体改变FADS2的表达（图1A）。通过流式细胞评估原代脂肪细胞的纯度，结果显示CD34-CD36+CD45-细胞群占整个组的50%以上，符合进一步分析的标准（图1B）。此外（图1C）显示了原代MAT脂肪细胞的FADS2蛋白表达有明显的上升或下降。首先对正常肠系膜脂肪细胞释放的可溶性因子对出现炎症情况的脂肪细胞的影响做了研究。从FADS2过表达MAT脂肪细胞（来自对照受试者）获得的脂肪细胞条件培养液ACM与从对照脂肪细胞ACM相比，抑制htMAT脂肪细胞中TNF-α和CRP的产生（图5A, B）。在这三组间，FADS2慢病毒处理的脂肪细胞ACM能够显著下调htMAT脂肪细胞中TLR-4表达和NF-κb活化（图5C）。FADS2过表达导致脂联素、抵抗素和阿普林分泌增加，而与对照组相比，脂联素瘦素的分泌大大减少。相反，来自FADS2沉默的脂肪细胞的ACM表现出脂联素水平显着降低，但促炎细胞因子分泌增加（图 5D）。脂联素和瘦素分泌的改变似乎依赖于Erk-2途径（图5E）。流式细胞对CD80, CD86和CD206的分析也进一步说明了巨噬细胞的极化。这些分析说明经FADS2过表达脂肪细胞的ACM处理后出现CD206的显著上调和CD80、CD86表达的下调（图5F）。对CD206巨噬细胞对T细胞的抑制试验也说明了其免疫抑制作用。
之后研究对未发生炎症的肠系膜脂肪组织进行FADS2干扰试验。Lv-FADS显著下调htMAT脂肪细胞中CRP和TNF-α的分泌（图6A）。瘦素是一种促炎脂肪因子，对脂肪细胞中FADS2的变化敏感，在FADS2过表达后会显著下调（图6B, C）。巨噬细胞基因标志物的表达情况说明巨噬细胞由M1型向M2型发生了转变（图6D）。通过CD80，CD86，CD206也证明了这一发现（图6E）。综上，体外试验说明肠系膜脂肪细胞中FADS2的过表达影响脂肪细胞炎症情况和巨噬细胞的活化。
4. FADS2过表达的抗炎症效应是由促分解脂质介质介导的
上述试验说明FADS2或许是炎症肠系膜脂肪细胞细胞因子释放和巨噬细胞表型转变的潜在调节因子。因此接下来的试验用于探究脂肪细胞和ACM的脂质成分是否会在FADS2水平发生改变后出现相应的变化。首先利用LM-MS分析未经处理，FADS2过表达（FADS2-慢病毒）和敲低的脂肪细胞（FADS2-siRNA）细胞成分中脂肪酸的情况。从脂肪酸谱图来看，与空白对照相比，FADS2-OV脂肪细胞中n-6:n-3 PUFA和ALA:DHA比例显著下降。相反的是，敲低FADS2使得n-6:n-3 PUFA比例增加，而LA:AA比例降低（图7A, C）。这些数据表明在FADS2过表达脂肪细胞中发生了n-3 PUFA生物合成的增加和DHA/EPA合并，说明FADS2参与EPA和DHA的细胞滞留。但FADS2-OV脂肪细胞的ACM并没有出现更高的n-6:n-3 PUFA比例或EPA和DHA积累，说明FADS2对PUFAs的分泌没有影响。考虑到PUFAs衍生的代谢产物对脂质介质很重要，并于炎症发生和消退有关，通过LC-MS/MS对ACM的PUFA代谢物进行分析。热图说明这些代谢物在过表达或沉默FADS2的肠系膜脂肪细胞中发生了明显的改变（图8A）。PCA展示了所有样本中PUFA代谢物谱在二维象限的明显区分（图8B）。PUFA代谢物中LTB4,17,18-diHETE, PGF-1a, PGE-1a 20-HETE, 5HETE, 20-HDHA, 9,10-DiHOME,12,13-DiHOME, 13-HODE, 14,15-diHETE, 11,12-DHET和12-HETE为最具显著差异物质（图8C-D）。经空白媒介、FADS2慢病毒和FADS2 siRNA处理的脂肪细胞中PUFA代谢物含量经one-way ANOVA分析。基于PCA结果（图8E），许多脂质在FADS2 OV脂肪细胞中增加，而在FADS2 KN脂肪细胞中减少，包括促炎症消退介质maresin-1，消退素resolvin E1，13(R)-HODE，PGE-3a，11-HDHA，5HETE和20-HDHA，而LTB4，TXB3，PGD-2和8-HADA仅仅在FADS2-OV脂肪细胞中下调。maresin-1，resolvin E1，13(R)-HODE，PGE-3a，5HETE和20-HDHA具有抗炎活性，而LTB4，TXB3，PGD-2和8-HADA具有促炎活性。综上，FADS2过表达增加抗炎脂质水平，下调促炎脂质水平。
图8 LC-MS/MS脂质组学分析结果显示脂肪细胞中由FADS-2调节的脂质介质有明显分泌现象
5. 递送FADS2-AAV减轻IL-10-/-小鼠肠系膜脂肪细胞和黏膜炎症
利用IL-10-/-小鼠研究FADS2过表达是否能促进肠系膜脂肪组织和在体肠道炎症的消除。通过向小鼠腹膜腔注射FADS2-LucAAV诱导FADS2过表达或敲除表型。小鼠分为四组，空白组，FADS2过表达组（FADS-2 OV），FADS-2敲除组（FADS-2 KN）和野生型组（WT）（图9A）。尽管腹腔注射FADS2-AAV显示已经整合到肠系膜脂肪细胞的基因组中，并增加FADS2表达，但并未影响肝脏组织中FADS2的表达（图9B）。
图9C, D显示接受FADS2-AAV处理的IL-10-/-小鼠结肠长度更长。结肠炎导致的结肠变化可以用病理评分衡量，在FADS2-OV小鼠中结肠评分下降，在局部FADS2敲除小鼠中评分增加（图9C, E）。此外，作为肠系膜炎症参数，经MAT相关FADS2过表达小鼠中MAT重量显著增加（图9C, F）。与未经处理的IL-10-/-小鼠相比，FADS2-OV小鼠肠系膜脂肪组织中每个区域中脂肪细胞数量减少，并且更少出现免疫细胞浸润（图9C, G）。与IL-10-/-小鼠相比，FADS2-OV小鼠有更低的疾病活动指数和体重减轻（图9H, I）。
在FADS2 OV组肠系膜脂肪组织中脂联素蛋白显著减少，而瘦素增加（图10A）。此外，在FADS2-OV小鼠MAT中M1型巨噬细胞经典标志物Tnf-α和Il-6基因表达水平显著下降（图10B），然而M2型巨噬细胞可选标志物Arg-1显著上调。结果说明FADS2-OV小鼠MAT冻存组织中CD206阳性巨噬细胞数量增加（图10C）。考虑到FADS2 AAV转染是一种过表达或敲低的相对非特异性方法，对会阴处和SVF巨噬细胞状态进行了比较。FADS OV和对照组小鼠的会阴巨噬细胞有相同比例的CD11b+iNOS+。然而，FADS OV和对照组小鼠相比，SVF相关的巨噬细胞CD11b+iNOS+比例有降低趋势。提示MAT内的组织相关巨噬细胞对FADS2变异更敏感，而与FADS2本身缺陷无关。此外，研究对SVF中Treg数量进行分析，发现在FADS OV，FADS KN和对照小鼠的CD25+Foxp3+数量无显著差异。Treg细胞核iNKT细胞特定转录因子基因表达也进行了分析，包括Foxp3，PLZF和E4BP4，说明脂肪组织iNKT细胞或许与巨噬细胞向M2型极化相关。
6. 促炎性细胞因子诱导肠系膜脂肪细胞FADS2表达缺陷并通过PPAR-α激活缓解
研究利用原代肠系膜脂肪细胞评估经TNF-α和IL-6处理8 h和24 h对FADS2基因表达的影响。图11A说明TNF-α和IL-6降低FADS2表达呈时间依赖性，与IL-6相比，TNF-α呈现更强的抑制作用。在炎症环境下，蛋白表达变异情况与mRNA变化保持一致（图11B）。先前研究证实，FADS2受固醇调节元件结合蛋白1c（SRBP-1c）和过氧化物酶体增殖物激活受体（PPAR-α）转录水平调控。研究发现，PPAR-α在受到刺激后降低，但当加入WY14643（PPAR-α激动剂）恢复，说明PPAR-α参与了TNF-α和IL-6刺激的原代脂肪细胞FADS2活化（图11B，C）。此外，在手术样本中也有相同的趋势表FADS2基因和蛋白表达与PPAR-α相关，表明FADS2表达与PPAR-α通路相关（图11D-F）。之后研究对3T3-L1细胞系中PPAR-α对FADS2蛋白表达调控能力做了分析。PPAR-α质粒和siRNA用于进行PPAR-α的过表达和敲除。当转染了PPAR-α质粒，细胞FADS2蛋白水平显著增加。相反，抑制内源性PPAR-α显著降低了FADS2蛋白水平（图11G，F）。
7. 合成配体WY-14643和ALA联用可改善TNBS诱导的结肠炎
为评估PPAR-α和n-3 PUFA对慢性炎症的影响，试验从TNBS诱导结肠炎的第1周开始，向小鼠施用含有或没有底物脂质ALA（0.1mg/kg）的PPAR-α激动剂WY14643。腹腔注射WY14643显著增加了TNBS诱导结肠炎小鼠MAT中PPAR-α和FADS2的水平，但对肝脏中FADS2的表达影响不显著。WY-14643与ALA联用恢复了小鼠因TNBS诱导的体重减轻，呈现更低的疾病活动指数和更高的存活率。在联用治疗后，与局部炎症相关的结肠长度和肠系膜重量显著改善，组织学情况也得到改善。研究测定了脂联素、瘦素和抵抗素的蛋白表达，和TNF-α，IL-6，IL-10和Arg-1的基因表达。在这些脂肪因子和炎症因子中，联用后炎症标志物下降而抗炎标志物增加。这些结果说明PUFA底物添加和FADS激活能够改善结肠炎过程中肠系膜脂肪组织功能。
评论
本研究旨在探索CD病症下代谢炎症的机制。研究整合了来自人类和小鼠的代谢组学分析和验证性实验中的数据，以定义FADS2在肠系膜脂肪组织中的新作用，这种作用可以通过临床上可用的抑制剂来靶向。越来越多的证据表明MAT可能在CD的发病机制中起重要作用。本研究是第一个使用非靶向代谢组学方法确定肠系膜脂肪组织代谢足迹的研究。从肥大的MAT中观察到的代谢物有明显不同的特征，这表明局部肠系膜中的代谢状态发生了改变（图2）。基于不同代谢物的代谢组学分析表明，与对照组相比，CD期间存在异常的不饱和脂肪酸水平（图3）。由于不饱和脂肪酸在人体内不能由短链饱和脂肪酸合成，而且不饱和脂肪酸的底物必须从膳食亚油酸（C18:2N6）和α-亚麻酸（C18:3N3）中获得，因此，MAT中不饱和脂肪酸代谢的改变主要源于PUFA的合成。因此试验对htMAT，nMAT和对照组样本的脂质组成进行了测定分析。htMAT的n-6:n-3比值增加，AA产量增加。反映通过脂肪酸去饱和酶2（FADS2）的通量的EPA/ALA和DHA/EPA比值在htMAT样品中较低。FADS2是产生长链PUFA的限速酶，尽管在该生物合成途径中还涉及两种额外的酶（FADS1/D5去饱和酶和延长酶）（图4A）。PUFA合成异常可部分归因于FADS2的失调。
FADS2在人肠系膜脂肪组织中的表达从未被研究过，尤其是在CD条件下。在这项研究中估了FADS2的表达，与正常组织相比，CD组织标本中的FADS2表达降低（图4）。相反，FADS1/D5去饱和酶和延伸酶在mRNA和蛋白质水平上没有显示差异。这些结果表明FADS2在改变PUFA合成，降低EPA和DHA含量以及LA和ALA的积累中起着关键作用。n-3和n-6 PUFA的显著变化与人类炎症状况相关，因为这些必需的PUFA是生成类花生酸介质的前列腺素和白三烯家族的代谢底物。因此在该基础上，试验探究FADS2的上调表达是否可以优化MAT中PUFA的组成，并进一步促进炎症的缓解过程。在这项研究中，对原发性肠系膜脂肪细胞进行取样，并在MAT微环境中模拟了脂肪细胞和脂肪细胞巨噬细胞的相互作用（图1）。实验结果表明，过表达FADS2促进了脂肪细胞之间的相互作用，并使巨噬细胞向着抗炎行为转变。
试验利用LC-MS/MS测量了ACM样品中的脂质组分（图7、8）。并定量了脂肪细胞中保留并分泌到ACM中的多不饱和脂肪酸水平。观察到细胞质而非分泌性脂质AA、EPA和DHA的转化率增加（图7A，B），这表明固有而非分泌性PUFA分布受肠系膜脂肪细胞中FADS2表达的影响。对这一结果的一种可能的解释是，细胞内积累的必需多不饱和脂肪酸被迅速代谢成次级代谢产物，而不是被运输到细胞外。有报道称EPA和DHA的保留可以改变细胞膜的组成和流动性，从而有助于控制发炎的脂肪细胞内的炎症。
考虑到体内稳态由促炎介质和消炎介质之间的平衡决定，试验对源自ACM的脂质进行了脂质组学分析。结果表明，FADS2 OV脂肪细胞ACM中的PUFA代谢产物发生了显着变化（图8）。研究发现了从PUFAs衍生的许多显着改变的类花生酸。在这项研究中，FADS2在肠系膜脂肪细胞中的增强被证明导致炎症较少的介质水平升高，从而导致向促溶解状态的转变。在这种情况下，研究试图确定脂质体内稳态失衡的巨噬细胞中的活化途径。研究主要评估了巨噬细胞脂质介体受体的变化。
与体外测定的结果一致，试验结果观察到腹膜内注射FADS2AAV载体可减轻自发性结肠炎小鼠的肠系膜和肠炎症（图9）。当MAT相关的FADS2过表达时，炎症细胞因子或脂肪因子的水平显着降低。此外，在FADS2激活下，M2巨噬细胞的浸润变得更加普遍，这表明FADS2促进了体内慢性炎症的有效控制。本研究发现，FADS2表达在48小时受到TNF-α的抑制。PPAR-α激动剂WY-14643解除了这种抑制作用，表明PPAR-α可能影响FADS2表达（图11A-C）。之后在MAT标本中观察到FADS2 mRNA水平与PPAR-α水平呈正相关（图11D-F）。随后通过核酸干扰证明了PPAR-α驱动的FADS2在3T3-L1细胞中表达的关键作用（图11G，H）。这些结果表明PPAR-α对脂肪细胞FADS2的表达具有转录调控作用。
基于这些结果，研究初步排除了MAT代谢紊乱在CD慢性炎症中起重要作用的可能性。如图12所示，炎症似乎通过FADS2失控从而影响PUFA及其次级代谢产物的代谢。基质中不平衡的分泌体促使局部巨噬细胞和脂肪细胞进入炎症敏感状态，进而加重肠系膜和黏膜炎症，形成恶性循环。在肠系膜脂肪细胞中靶向PPAR-α可以挽救FADS2的下调，并进一步纠正MAT内LM的不平衡。
图12 假设和获得的结果的示意图
研究发现CD患者肠系膜脂肪细胞具有PUFA代谢紊乱的特征。结果表明，FADS2在代谢和炎症稳态中起着中心作用。FADS2的表达改变了脂肪细胞源性脂质介质的水平，可能是CD患者预防慢性炎症的一个保护因素。另外，尽管还需要其他研究来验证在其他组织中的发现，但这项研究的结果揭示了CD营养疗法的有希望的目标。
评论
本研究利用非靶向代谢组学方法确定肠系膜脂肪组织代谢物特征。从肥大的MAT中观察到的代谢物有明显不同的特征，这表明局部肠系膜中的代谢状态发生了改变。CD患者肠系膜脂肪细胞中PUFA代谢紊乱。PUFA合成异常可部分归因于FADS2的失调。结果表明FADS2在改变PUFA合成，降低EPA和DHA含量以及LA和ALA的积累中起着关键作用。FADS2在代谢和炎症稳态发挥重要作用。以原发性肠系膜脂肪细胞为样本，并在MAT微环境中进行模拟实验，发现过表达FADS2促进了脂肪细胞之间的相互作用，并使巨噬细胞向着抗炎行为转变。利用体内试验，对FADS2进行过表达，发现FADS2可有效控制慢性炎症。核酸干扰试验证明了PPAR-α对脂肪细胞FADS2的表达具有转录调控作用。FADS2的表达改变脂肪细胞衍生的脂质介质，在肠系膜脂肪细胞中靶向PPAR-α可以挽救FADS2的下调，并可能成为对抗CD患者慢性炎症的保护因子，为CD营养疗法提供了前景。