科研| ENVIRON INT：长期暴露于四环素水生环境，会增加斑马鱼的体重（国人佳作）
编译：思越，编辑：谢衣、江舜尧。
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四环素（TET）广泛应用于医学治疗和畜牧业，在水生环境中常以较高的浓度被检测到。TET对斑马鱼（Danio rerio）在胚胎和幼虫阶段的影响已被报道，但对于其长期影响的报道仍较少。在这项研究中，作者将幼斑马鱼暴露于1µg / L和100 µg / L的TET水平一个月直至成年，结果表明，两种水平的TET均显着增加斑马鱼的体重，但对体长没有影响。TET暴露同时还通过产生脂质空泡影响肝脏的微结构，全脂质组学分析显示，肝甘油三酯（TAG）水平显着上调。代谢组学分析显示，包括亚油酸代谢，酪氨酸代谢和蛋氨酸代谢在内肝脏代谢通路发生严重失调，进而通过肝脂质蓄积使体重增加。同时发现，参与脂质转运和脂肪形成因子的肝脏基因表达显著上调。基于16 rRNA的肠道微生物群落分析显示，两种水平TET的长期暴露增加了微生物种群的多样性，并改变了微生物群落的组成。表明水生系统中，抗生素存在的生态毒性。
论文ID
原名：Long-term exposure to TET increases body weight of juvenile zebrafish as indicated in host metabolism and gut microbiome
译名：宿主代谢组和肠道微生物组显示，长期暴露于四环素使斑马鱼的体重增加
期刊：Environment International
IF：7.943
发表时间：2020年4月10日
通讯作者：董武&方明亮
通讯作者单位：内蒙古民族大学&南洋理工大学
实验设计
将后代的斑马鱼在循环AHAB系统喂养，直到受精后60天。选择1μg/ L和100μg/ L的四环素代表环境中的低和高浓度。随机将120条鱼分成三组，每组4个水箱（每箱10条鱼），向两组分别以1μg/ L和100μg/ L的剂量添加TET，对照组不暴露于TET。在对照和TET剂量组发育30天后，将鱼处死并测量体重和长度。解剖储存肝脏样品和肠样品。部分肝脏样品，用于肝组织的组织病理学分析。
将每个水箱中的三只斑马鱼的肝组织汇集作为一个样品，提取总RNA并逆转录为cDNA，使用PrimerQuest合成肝基因引物，通过实时PCR定量肝脏基因的mRNA表达。将肝脏样品超声破碎后，进行代谢物和脂质的提取。将处理过的样品和对照样品的合并混合物通过LC-MS/MS检测进行代谢组学分析，并筛选和鉴定差异代谢物。KEGG和Metaboanalyst用于进一步的通路分析，R软件进行热图分析。使用反相HPLC系统进行脂质谱分析，使用内置LipidBlast数据库的MS-DIAL（V.2.84）软件进行脂质亚类的分析和注释。
将每个水箱中的三只斑马鱼的肠样品汇集作为一个样品，提取DNA并扩增16S rRNA的V3-V4可变区，进行肠道微生物组分析。将归一化的序列与SILVA数据库进行比对，并以70％的阈值聚类为不同的分类学级别。通过PAST进行肠道微生物群落，包括非度量多维标度（NMDS）分析和Bray-Curtis指数计算。使用PICRUSt预测KEGG类别并结合功能性酶以研究微生物群落的功能变化。
实验结果
1.斑马鱼体重增加并伴随肝脏微结构变化
与对照相比，1μg/ L和100μg/ LTET处理的斑马鱼，体重均显着增加（图1a），但是，体长没有变化（图1b），体重指数（BMI）增加。由于暴露于抗生素和体重增加可能会改变肝脏功能的变化，作者接下来对斑马鱼肝脏进行了组织病理学分析。通过H＆E染色的显微图像发现，长期暴露于TET使斑马鱼的核染色质发生浓缩且生成脂质液泡，说明脂质堆积与体重增加有关（图1c）。
2.斑马鱼肝脏中的脂质失调
前人研究发现，随着肝脂质液泡形成而使体重增加，可能与肝脂质蓄积有关。作者接着进行了脂质组学分析，以比较对照组和TET处理组之间肝脂质组的差异。整体脂质谱分析发现，在100 µg / L TET暴露下功能失调的脂质数量是1 µg/L的1.2倍（图2a）。通过对脂质进行注释，并分为甘油磷脂，甘油脂和鞘脂脂质三类，发现100μg/ L TET处理的斑马鱼肝脏甘油三酸酯（TAG）的增加水平是1 µg / L的1.5倍，并展示一些代表性的TAG（图2c），鞘磷脂（SM）的水平仅显示出轻微的增加（图2b）。结果表明，暴露于较高剂量的TET时，脂质更容易发生失调。
图2 暴露于TET斑马鱼肝脏中的脂质变化。（a）脂质谱分析的上调和下调显着特征；（b）脂质类别占总鉴定脂质的百分比的条形图；（c）具有显著性的TAG相对于对照的倍数变化
3.斑马鱼肝脏中的代谢变化
作者接着进行非靶向代谢组学分析，探讨可能与TET诱发的肥胖和肝异常相关的代谢变化。在ESI（+）和ESI（-）模式下，100 µg / L TET暴露下功能失调的代谢物数量分别是1 µg/L的1.4和1.3倍（图3a）。结果表明，较高剂量的TET会引起斑马鱼肝脏中反应性更强的代谢产物。通过MS / MS数据和保留时间匹配，鉴定出35种代谢物在暴露于TET后发生失调（图3b）。通过热图发现，1 µg/L组中，亚油酸，油酸和苯丙氨酸的倍数变化为1.9、1.9和1.3倍；100 µg / L 组中，硬脂酸，s-腺苷甲硫氨酸和丝氨酸的倍数变化为4.1、4.1和1.4倍。代谢途径的富集分析显示，在100μg/ L的TET暴露下，甲基组氨酸和蛋氨酸的代谢途径发生显著变化（图3c）。
图3 暴露于TET斑马鱼肝脏中的代谢变化。（a）代谢组学分析的上调和下调显著特征；（b）有显著差异代谢物的热图分析（热图值代表相对于对照的丰度比；蓝色代表相对于对照的上调代谢物，红色代表下调）
4.肝脂质代谢相关基因的表达变化
作者分析了与斑马鱼肝脏脂质转运和形成高度相关的靶基因表达情况，包括脂质转运（apoa4，fabp2和fabp11）和脂肪形成因子（pparαb，pparγ和c /ebpα）所涉及的基因表达变化。结果显示，在TET暴露下，斑马鱼肝脏中的蛋白上调，且具有明显的剂量依赖性（图4）。
图4 暴露于TET斑马鱼肝脏中脂质代谢相关基因的表达。（a）脂质转运（apoa4，fabp2和fabp11）和（b）脂肪形成因子（pparαb，pparγ和c /ebpα）
5.肠道菌群失调
在先前研究有关小鼠和猪的研究中，观察到了由抗生素暴露引起的肠道菌群失调，以及肠道菌群失调相关的肥胖症。于是作者观察TET暴露后斑马鱼肠道微生物的变化。作者共收集到515052条序列，并基于0.97的阈值通过聚类得到105个OTU，且大部分属于暴露于TET的样品。
同时，稀疏曲线表示，TET暴露下样品的种群丰富度高于对照组，尤其在1 µg / L组中更明显。作者进一步通过α多样性指数（包括Chao指数、Sob指数和Shannon指数）证实了TET暴露下的微生物多样性显著提高（图5a）。非度量多维尺度分析（NMDS）分析显示每组间的点紧密聚集。通过计算样本间的Bray-Curtis指数，并通过非参数多元方差分析（PERMANOVA）显示，三组间的系统发育结构差异有显著性，但两两比较差异不显著。
对微生物群落门的水平进行分析，相对丰度最大的分别是梭杆菌门、厚壁菌门和拟杆菌门（图5b）。分别对不同暴露状态下，相对丰度的变化分析发现：在100µg / L暴露下，厚壁菌门降低了6.2倍；在1µg/L暴露下，拟杆菌门降低了2.4倍，变形菌门升高了2倍。有趣的是，拟杆菌门和厚壁菌门的比值在1µg/L暴露下增长了2.9倍，而在100µg/L暴露下降低了0.19倍，这可能解释1µg/L暴露下小鼠具有更高体重的原因。此外，厚壁菌门通常被认为是与肥胖有关，但在本研究中未观察到明显变化。
为了确定组间有显著差异的群落，作者进行了LEfSe（LDA Effect Size）分析（图5c和图5d），共鉴定出15个类群具有显著差异，LDA的阈值为3.5。其中，1μg/ L TET暴露下样品中有8个类群显着富集，100μg/ L TET样品中有7个类群。在1μg/ L TET暴露组中，厚壁菌（门）、Ersipelotrichia（纲） 、丹毒丝菌（目）、Erysipelotrichaceae（科）、Erysipelotrichaceae_g_norank（属）显著富集，且Ersipelotrichia约占种群的16.3%，而对照组和100µg / L暴露组中分别占14.3%和2.3%。有趣的是，Ersipelotrichia种群数量的增加被报道与高质饮食引起的动物肥胖有关，提示可能是斑马鱼体重增加的潜在生物标志物。
图5 暴露于TET斑马鱼肠道菌群微生物群落变化。（a）微生物多样性指数；（b）门水平的相对丰度；（c）微生物丰度的LEfSe分析；（d）LDA评分
6.肠道微生物组功能预测
考虑到肠道微生物群落的功能能力可能导致宿主生理发生改变，作者研究了TET诱导的斑马鱼肠道微生物组功能变化。作者使用PICRUSt预测宏基因组的功能基因组成。共预测了129个KEGG功能和207个同源蛋白簇（COG）的相对丰度高于0.1％。膜转运，碳水化合物代谢和氨基酸代谢是高度丰富的KEGG代谢途径。氨基酸转运和代谢，碳水化合物转运和代谢及能量产生和转化是肠道微生物组中高度丰富的COG功能（图6a）。其中，相比于对照组，TET暴露下脂质转运和代谢途径的COG丰度更高（图6b），可能是斑马鱼宿主体内脂质蓄积而引起体重增加的原因，但具体机制尚未明确。
图6 暴露于TET的肠道菌群功能变化。（a）COG功能分类和（b）脂质转运和代谢的COG丰富度
讨论
本文研究了长期暴露于TET在幼年期对斑马鱼的影响。通过接触与环境水平相当的TET可能会增加斑马鱼的体重，并伴有肝脂质的积累。发现了一些代谢物和代谢途径，例如脂肪酸和蛋氨酸的代谢，可能通过肝脂质蓄积引起体重增加。此外，观察到肠道微生物群的改变和多样性的增加，例如拟杆菌门和厚壁菌门之间的比率，并确定了肥胖的潜在生物标志物。但是，仍然需要进行进一步的体内研究，例如粪便移植，以验证这种联系并阐明斑马鱼中诱导的体重增加背后的机制。此外，将来的研究中也可以考虑使用不同剂量的TET以探究剂量-反应关系。
原文网址：https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0160412019348858?via%3Dihub#b0135