流式荧光染色法实验原理及步骤

原理：

荧光染料CFSE， 即羟基荧光素二醋酸盐琥珀酰亚胺脂，是一种可穿透细胞膜的荧光染料，具有与细胞特异性结合的琥珀酰亚胺脂基团和具有非酶促水解作用的羟基荧光素二醋酸盐基团，这使得CFSE成为一种良好的细胞标记物。当细胞进行分裂增殖时，具有荧光的胞质蛋白被平均分配到第二代细胞中，这样与第一代细胞相比，其荧光强度便会减弱至一半；以此类推，分裂得到的第三代细胞的荧光强度便会比第二代细胞再次减弱。这种现象可以在488nm的激发光下，采用流式细胞仪检测分析，通过检测到细胞荧光强度不断的降低，进一步分析得出细胞分裂增殖的情况。

实验步骤，以小鼠脾细胞为例：

1.取一只6-8周小鼠颈椎脱臼处死后，将其全部浸泡于75%酒精中；

2.在超净工作台上无菌取出小鼠脾脏；

3.用无菌注射器内芯研磨脾脏，尽量不残留较大组织块；再用3mlPBS冲洗后，将脾脏研磨液经200目尼龙网过滤至15mL离心管中，离心350g，5min；

4.弃上清后，加入2mL红细胞裂解液，轻微吹打，裂解2min后加入等体积PBS终止裂解反应，混匀后离心350g，5min；

5.弃上清，用RPMI1640完全培养基重悬沉淀，并取10μL细胞液计数，将细胞浓度调至2.0×106/ml；

6.提前将CFSE按照说明书用DMSO配成5mM母液，并分装储存于-80冰箱，其工作浓度为0.5-25μM；

7、取部分细胞作为不染色组阴性对照，其他细胞加入CFSE溶液，使得终浓度为5μM，37°C避光孵育15min；

8、加入1ml冰冷的RPMI1640完全培养液，4℃，5min以中止染色；

9、弃上清，加入冰冷的含10%FBS的完全1640培养液洗2次，最后用1640完全培养基重悬细胞沉淀，充分吹打成单细胞悬液，将上述细胞悬液加入96孔培养板,每孔105个细胞（阳性对照用PHA刺激）；

10、37℃，5%CO2培养3天后用流式细胞仪分析细胞488nm激光器检查细胞增殖情况。

结果分析：用FlowJo分析细胞增殖

在FSC/SSC 上圈出目标细胞，使用 FSC-W/FSC-A 排除黏连体，使用 CFSE 单参看目标细胞的增殖情况。以下图片来源于网络：细胞摄取染料后，信号最强，在最右边（不分裂的话，就是那个桃红色的峰），随着细胞的每一次分裂，细胞内染料的浓度被稀释一倍，信号也减弱一半，以此类推，由于细胞的分裂不同步，所以最后的结果是红色的那些齿状的峰。

对照组：

实验组：

实验要点：

CFSE的浓度国外报道从0.5uM-20uM都有，建议终浓度为2.5-5uM。浓度太低，细胞标记的荧光强度不够，太高了对细胞有毒性，且影响细胞增殖。标记孵育时要经常摇匀。