专家论坛｜合并非酒精性脂肪性肝病的慢性乙型肝炎患者HBV复制与脂代谢的相互影响
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http://www.lcgdbzz.org/cn/article/doi/10.3969/j.issn.1001-5256.2021.07.002
慢性HBV感染是我国病毒性肝炎、肝硬化和肝细胞癌的最常见病因，也是世界性公共卫生问题。虽然广泛的乙型肝炎疫苗接种已使我国的全人群HBsAg阳性率下降至5%~6%，但慢性HBV感染者仍有7000万之多[1]。随着生活方式的改变，我国非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)患病率逐年升高，1999年—2018年我国NAFLD总患病率已达29.2%[2]。在部分地区的慢性乙型肝炎(CHB)患者中，NALFD的患病率已达14%[3]。
目前，HBV与NAFLD之间的相互作用尚不清楚。有研究[4]显示，HBsAg阳性与NAFLD患病率呈负相关关系，HBV感染人群(HBsAg阳性)的NAFLD患病率明显低于未感染人群，而HBV既往感染人群(抗-HBc阳性且HBsAg阴性)NAFLD的患病率与未感染人群相比则无明显变化[5]。而在另外的一些研究[6-7]中未发现CHB患者与无HBV感染者NAFLD发生率的差异。因此，进一步明确HBV复制与肝细胞脂代谢的相互作用机制，探究合并NAFLD的CHB患者的病毒复制规律、脂代谢异常及其对疾病进展的影响，将有助于HBV抗病毒治疗、为预防HBV合并NAFLD患者终末期肝病的发生提供新的思路。
1HBV病毒复制周期
HBV属于嗜肝DNA病毒科，其存在形式包括直径为42 nm的大球形颗粒(Dane颗粒)和直径为22 nm的管状颗粒和小球型颗粒。Dane颗粒由包含大(L-HBs)、中(M-HBs)和小(S-HBs)三种表面抗原蛋白的脂质膜包裹HBV核心蛋白(HBc)、病毒聚合酶(Pol)和松弛环状的病毒基因组DNA(rcDNA)组成的核衣壳构成，具有感染性；而管状颗粒和小球型颗粒缺乏核衣壳结构，为HBsAg及膜结构构成的无传染性亚病毒颗粒[8]。
HBV对肝细胞的特异性感染由病毒囊膜蛋白L-HBs的PreS1氨基端序列与肝细胞特异性表达的牛磺胆酸钠共转运蛋白(NTCP)特异性结合所介导[9]。内化后的病毒核衣壳将rcDNA带入细胞核形成共价闭合环状DNA(cccDNA)并做为病毒复制的模板。cccDNA可以转录出4种不同长度的病毒mRNA(3.5 kb、2.4 kb、2.1 kb和0.7 kb)。该转录过程受一系列的细胞因子调控，主要包括肝细胞核因子3(HNF3)、HNF4、视黄酸X受体α、过氧化物酶体增殖物激活受体(PPAR)、肝X受体LXR)和法尼醇受体(FXR)等[10-15]。
在病毒的复制过程中，3.5 kb的前基因组RNA(pgRNA)可作为mRNA翻译出HBV核心抗原(HBcAg)和P蛋白，同时也是逆转录合成子代病毒DNA的模板。首先，P蛋白与pgRNA的ε区结合并招募HBcAg形成核衣壳。随后pgRNA在P蛋白反转录酶和DNA聚合酶活性的催化下在核衣壳内先后合成出HBV DNA的负链和正链，形成核衣壳。最后，带有rcDNA的核衣壳进入细胞多囊泡小体(MVB)被含有HBsAg的囊膜结构所包裹，以出芽的形式释放出肝细胞。Dane颗粒通过依赖内吞体分选转运复合体(ESCRT)途径外泌，而裸衣壳的释放并不需要上述ESCRT机制，而是涉及Alix和HGS的相关调控[16-17]。在亚病毒颗粒的释放中，小球形颗粒主要经过内质网的一般分泌途径进行，含有大表面抗原蛋白的管状颗粒同样可以经过ESCRT依赖性的途径出胞[18]。
此外，对患者血浆中纯化的HBV颗粒使用甲基-β-环糊精萃取胆固醇后病毒颗粒外观无明显变化，但出现了密度升高(1.23 g/ml vs 1.17 g/ml)和直径降低(39 nm vs 48 nm)的现象，并失去感染性。尽管通过外源性添加胆固醇或胆固醇类似物可使病毒颗粒的密度及直径恢复正常，但感染性无法得到恢复。上述研究提示，病毒的排出途径与细胞膜分选机制密切相关，在释放过程中需要大量的含胆固醇在内的宿主细胞脂质膜结构。并且，HBV的感染性与病毒包膜的胆固醇含量及结构有关[19]。
2脂代谢的主要调节通路
肝脏是全身脂质代谢最重要的器官，参与脂质吸收、重构和分配。肝脏脂质的主要来源包括以乙酰辅酶A等为原料的从头合成、肠道吸收后经载脂蛋白运输并被肝细胞吸收。肝脏脂质合成代谢的异常与NAFLD的发生密切相关。其中从头合成占肝细胞内总脂质的20%。
目前公认的脂肪酸合成限速酶有乙酰辅酶A羧化酶、脂肪酸合成酶(fatty acid synthase, FASN)、硬脂酰辅酶A去饱和酶1等[20]。下列转录调控因子能够通过作用于脂质从头合成限速酶来发挥调控作用，包括LXR、碳水化合物反应元件结合蛋白、SREBP-1c、上游转录因子1/2等。
除了从头合成，肝细胞还通过被动扩散，和辅助膜受体CD36、脂肪酸结合受体1(FABP1)介导下主动摄取脂肪酸[21]、由低密度脂蛋白受体(LDLR)介导的内吞作用从胞外摄取胆固醇，以及由低密度脂蛋白受体相关蛋白1介导的内吞乳糜微粒途径来摄取甘油三酯[22]。
肝脏脂质的去路主要为以极低密度脂蛋白胆固醇形式输送到其他肝外组织，以及通过β氧化代谢脂肪酸。在脂肪酸β氧化过程中，FABP将其所结合的脂肪酸带入线粒体，随后转录因子PPARα等通过调控限速酶如长链脂酰辅酶A脱氢酶、酰基辅酶A氧化酶和短链特异性酰基辅酶A脱氢酶影响脂肪酸β氧化过程。
总之，脂肪酸合成、摄入及分解受到一系列代谢相关酶类以及转录因子的调控。正常生理条件下，肝脏脂质维持平衡状态。
3HBV对脂代谢的影响
HBx是最早被发现可通过影响多个信号通路诱导肝细胞发生脂肪变性的病毒蛋白[23]。Kim等[24-25]的系列研究发现，HBx可通过增强核受体超家族成员LXR-α与LXRE的结合促进FASN及SREBP-1c转录，或通过TNFα及其受体1 (TNFR1)介导NF-κB通路的激活上调SREBP-1c和PPARγ的表达，从而动员胞内脂质的从头合成，诱导肝细胞脂质堆积[26]。PI3K-Akt途径是重要的细胞增殖、代谢调节通路，HBx还可以通过影响Akt对底物糖原合酶激酶-3β(GSK-β)的磷酸化失活，稳定SREBP-1c核定位，并通过激活Akt下游哺乳动物雷帕霉素靶标复合物1刺激脂肪生成[27]。
烯酰辅酶A水合酶1位于线粒体基质中，是催化脂肪酸氧化的关键酶。HBsAg可能具有抑制烯酰辅酶A水合酶1活性、促进肝细胞脂质堆积的作用[28]。此外，Oehler等[29]利用人类肝脏嵌合小鼠模型发现，PreS1与NTCP的结合会干扰肝细胞胆汁酸的吸收，从而引起CYP7A1的表达上调，及SREBP-2、3-羟3-甲基戊二酰辅酶A还原酶和LDLR表达升高，进而促进胆固醇向胆汁酸的转换，并同时促进胆固醇的从头合成及胞外摄取。该研究还发现，HBV能够从转录水平上调载脂蛋白A1。考虑到载脂蛋白A1是逆向运输胆固醇回肝脏的重要载脂蛋白，其增加是否会促进脂质向肝细胞的运输值得进一步研究。
4脂质代谢通路对于HBV复制的影响
HBV基因组转录高度依赖于肝脏富集的代谢核受体。其中FXRa能够增强HBV核心启动子活性，进而提高pgRNA水平。研究[30]显示，代谢调节分子和糖原异生关键基因的共激活因子PPARγ辅助激活因子1α(PGC-1α)能够在激活糖异生的同时，激活HBV相关基因HNF4α的表达，两者协同促进BCP或EnhancerⅠ的转录活性。在Huh7细胞中，能量代谢传感器SIRT1能够以FXRα和PGC-1α依赖性方式激活核心启动子，FXRa激活剂GW4064能够10倍提高核心启动子活性，联用SIRT1的特异性激活剂ACT3能够进一步使核心启动子控制的荧光素酶表达增加25倍[31]。
已知HBx可通过促进LXR-α与LXRE的结合进而促进FASN及SREBP-1c转录上调，动员胞内脂质的从头合成和脂质堆积[24-25]。内源性LXR的激动剂氧固醇可以通过激活LXRα，进而影响HBV的基本核心启动子的转录活性，上调HBx及3.5 kb mRNA的水平[32]。但也有研究[33]显示，在HBV感染的人原代肝细胞中，LXR激动剂(T0901317、GW3965和LXR-623)而非LXR拮抗剂(SR9238)能够降低胞内HBV RNA、HBV DNA和上清中的HBsAg及HBeAg水平。该研究进一步显示，LXR激动剂可能是通过降低CYP7A1的mRNA及蛋白水平发挥其抗病毒作用。对于报导的LXR调控HBV作用的这些不一致性，还需进一步的相关研究确定。
过氧化物酶体增殖物激活受体PPAR包括PPARα、PPARβ/δ和PPARγ三种类型，是脂质代谢及炎症反应相关的重要细胞因子[34]。其中PPARα主要位于肝脏，参与调节脂肪酸运输、β-氧化和生酮作用。PPARγ在脂肪组织中高表达，参与脂肪储存和脂肪因子的分泌。有研究[15]显示，在不支持HBV复制的小鼠成纤维细胞NIH3T3中过表达外源PPARα后，可使之获得支持HBV复制的能力。与之一致，通过Wy-14, 643和氯钡酸处理激活HBV转基因小鼠的PPARα后，小鼠血清中的HBeAg及肝细胞内HBV DNA均出现了升高，而通过小干扰RNA抑制PPARα可抑制HBV复制[13]。此外，miR-141也可通过靶向抑制PPARα抑制HBV的复制[35]。
但用PPAR的激动剂苯扎贝特和罗格列酮处理细胞并未观察到促进HBV复制的现象，罗格列酮处理甚至降低了培养上清液中HBV DNA、HBsAg和HBeAg水平，细胞中的HBV复制中间体也被抑制[36]。对于这种矛盾的现象，目前尚缺乏合理的解释。此外，激活PPARγ也可以增强HBV稳定转染细胞的病毒复制能力[37]。
5胞内脂质对HBV复制的影响
既往以HBV转基因鼠或HBV超基因组质粒DNA尾静脉水压动力注射等联合高脂饮食，构建NAFLD合并HBV复制小鼠模型，研究[38-39]结果显示，合并脂肪肝小鼠的血清HBeAg、HBsAg及HBV DNA水平均出现明显下降。这与临床观察到的HBV合并NALFD患者病毒载量较低的现象相符，提示胞内脂质水平对于HBV复制具有重要影响。由于胞内脂质种类繁多，对于不同种类脂质对于HBV复制的影响需进一步论述。
5.1 胞内胆固醇对于HBV复制的影响
使用竞争性的HMG-CoA还原酶抑制剂洛伐他汀(Lovastatin)抑制胆固醇合成，可降低HepG 2.2.15细胞培养上清的HBsAg水平，但HBV DNA水平未见明显变化[40]。进一步，用缺乏脂蛋白的血清培养HepG2.2.15可在24 h内使细胞内胆固醇水平降低40%，对应上清中的HBV DNA水平出现80%的下降，HBsAg的水平不受影响，这可能与胆固醇在维持L-HBs的拓扑结构中发挥的重要作用有关[41]。但在HepAD38细胞中，用胆固醇生成抑制剂NB598处理6天后培养上清的HBV DNA水平出现明显下降，而HBsAg水平未受到影响[19, 42]。
5.2 鞘脂对于HBV复制的影响
鞘脂可能以3种方式影响病毒复制：在病毒进入过程中充当(共)受体、调节病毒复制和影响病毒免疫应答。多项研究表明，鞘氨醇激酶及其产物鞘氨醇-1-磷酸可增强HBV、麻疹病毒和流感病毒的复制；神经酰胺尤其是鞘氨醇-1-磷酸和鞘氨醇激酶1，能够通过增强树突状细胞的成熟、分化和在组织中的定位，影响IFN-Ⅰ的表达；除此以外，α-半乳糖基神经酰胺也具有刺激自然杀伤细胞活化和IFNγ分泌的作用。
丝氨酸棕榈酰转移酶(SPT)是催化鞘脂生物合成的第一步。研究[43]显示，SPT抑制剂Myriocin可以降低转染了HBV C基因型表达质粒的Huh7细胞培养上清液中的HBV DNA水平，与PEG-IFN联用可进一步将HBV水平降低至对照水平的1/1000，并导致HBV表面抗原和核心蛋白水平的降低，同时不会引起肝毒性。另一种SPT抑制剂球壳菌素也能够明显降低上述Huh7细胞培养上清的HBV水平[44]。
5.3 磷脂对于HBV复制的影响
已知HBV利用宿主MVB途径获取带有HBsAg的脂质包膜，而该包膜的90%以上由磷脂构成[45]。研究[46]表明，HBV复制可引起小鼠肝脏中磷脂酰胆碱(PC)组成的改变，Huang等[47]进一步通过代谢组学确定了一组在CHB患者中成分或含量发生改变的生物标志物，主要包括溶血磷脂酰胆碱、磷脂酰胆碱、磷脂酰肌醇和磷脂酰丝氨酸。近期，他们在HepG 2.2.15细胞中发现，抑制磷脂生成后HBV的复制受到了抑制[45]。
上述研究提示，磷脂在HBV复制及感染可能具有重要作用。PC是生物膜的主要磷脂成分。Li等[48]的研究发现, HepG2.2.15中PC的主要成分总脂肪酸含量明显增加，表明在HBV复制的HepG2细胞中脂肪酸生物合成的增强。但目前尚缺少有关PC生物合成增加是否影响HBV复制的研究。
5.4 脂肪酸对于HBV复制的影响
脂肪酸是构成脂质膜的主要成分之一，因此长链脂肪酸对于形成病毒外包膜可能具有重要价值。鉴于前期研究中发现HBx具有通过激活SREBP1进而增强脂质合成相关基因表达的功能[25]，HBV也可能通过促进细胞脂肪酸的产生，为病毒复制提供充足的外包膜使其正常释放[49]。另一基于Hep 2.2.15细胞的实验[50]同样显示，用脂肪酸从头合成途径的抑制剂FASN处理，在有效降低胞内长链脂肪酸水平的同时，培养上清HBV DNA水平降低至对照组的50%，HBsAg降低至80%，且上清中白蛋白水平未见影响，提示FASN抑制剂可能不通过抑制细胞蛋白质合成和分泌过程发挥作用。长链脂肪酸可能在Dane颗粒的形成或运输过程中发挥作用，进而影响到Dane颗粒的释放。
使用经诱导成熟分化的HepaRG细胞和原代人肝细胞的相关研究[51]发现，在感染及感染后2 h内在培养上清中添加富含脂质成分的载脂蛋白，在感染后第10天的检测结果显示，培养上清的HBeAg及胞内的cccDNA水平均明显降低，提示富含脂质成分的载脂蛋白能够抑制HBV对培养细胞的感染。因此HBV在感染过程中的进入细胞阶段可能利用、甚至依赖细胞通过载脂蛋白摄取脂质的途径。的确，使用脂肪酶抑制剂奥利司他处理来抑制细胞对脂肪的吸收后，细胞培养上清HBeAg及胞内cccDNA均下降，但如果在病毒感染细胞阶段结束后再用奥利司他处理，其对于HBV复制活性的抑制作用消失，提示奥利司他是通过抑制病毒颗粒的进入、而不是通过影响HBV的基因表达或复制发挥作用。以上结果抑制脂肪酶可靶向HBV感染的早期步骤。
6总结
我国的HBV感染仍处于较高流行阶段[1]，随着社会快速发展带来的营养过剩和不良生活习惯的增加，慢性HBV感染者中合并NAFLD的患病率呈现逐年升高的态势[2]。慢性HBV感染合并NAFLD，及其与之相关的肝纤维化、肝硬化及肝癌是目前及之后相当长时间影响我国公共卫生的主要问题。因此，探究合并NALFD的CHB患者中HBV复制与脂代谢异常及脂肪肝发生的相互影响，具有重要的理论和现实意义。
HBV的生活周期涉及多个步骤，其中通过MVB途径获取包膜是感染性病毒颗粒的重要释放途径。从HBV与脂代谢的相互作用机制上看，HBx能够在细胞模型及小鼠模型促进胞内脂质的从头合成及体外摄取，进而增加脂质的胞内堆积[24]；反过来，脂代谢的重要调节通路如PPAR、LXR、FXR能够在转录水平调节胞内HBV的复制[31-32]。
不同于体外及动物实验中观察到的, HBV具有促进脂质合成及摄入的能力，但多数临床研究及系统综述显示，HBV感染者NAFLD发生率较低。上述矛盾现象可能与临床研究中纳入的HBV感染者或CHB患者的病毒载量及免疫状态有所不同有关。未来需要更好的实验模型，以便对临床发现的HBV感染者NAFLD发病率较低、但一旦发生严重脂肪变及NASH后的慢性HBV感染者疾病进程严重化等现象进行解释，并为更优治疗方式的选择提供思路。同时，进一步明确脂代谢调节通路对HBV的影响，也将有助于HBV的药物研发与抗病毒治疗方式的选择。
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本文编辑：林姣
公众号编辑：邢翔宇
全网首发｜《临床肝胆病杂志》2021年第7期“慢性HBV感染重叠非酒精性脂肪性肝病”重点号（执行主编：赵景民）
述评｜赵景民：慢性HBV感染重叠非酒精性脂肪性肝病临床与基础研究的现状及展望