体外冲击波碎石术治疗患者中一氧化氮和内皮素血清水平的变化
Int J Appl Basic Med Res . Apr-Jun 2019;9(2):80-84.
doi: 10.4103/ijabmr.IJABMR_331_18.
Variations in Nitric Oxide and Endothelin Serum Levels in Extracorporeal Shock Wave Lithotripsy-Treated Patients
前言
体外冲击波碎石术 (ESWL) 是一种治疗尿路结石的方法，它也会带来病理生理学后果，这对患者来说可能非常重要。内皮素 (ET) 是一种有效的血管收缩肽，从培养的猪主动脉内皮细胞中分离出来。[1] ET 生物合成开始于产生 pre-pro-ET，在特定内肽酶的作用下，通过 pre-pro-ET 水解，在内质网中转化为 pro-ET 或大 ET。在进一步的过程中，细胞内产生的一部分pro-ET已经在细胞内水平加工成成熟的ET，而另一部分则以不变的形式排出体外，并在外周组织中转化为成熟的形式。 在这一发现之后，ET 同种型 ET-2 和 ET-3 很快就从内皮细胞中分离出来。除了猪主动脉内皮细胞外，许多组织中都存在 ET 合成。因此，例如，关于 ET-1，在心脏、肺、肝、脾、胃、小肠和大肠、肌肉和睾丸中发现了 mRNA。关于 ET-2，在胃、小肠和大肠、胰腺和肌肉中发现了 mRNA，而在 ET-3 中，在中枢神经系统中发现了 mRNA，特别是在视上神经元中。
ET-2 与 ET-1 结构相似，唯一的区别是两个氨基酸，而 ET-3 的不同之处在于六个氨基酸的分布。肾血管系统对 ET-1 的血管收缩作用极为敏感，比任何其他血管床都多。[2]这种前所未有的敏感性部分与在所有肾抵抗血管的血管平滑肌组织中发现的高密度 ETa 受体有关。[3] ETb受体通常分布更广，在肾集合管中浓度高。ET-1 是在内皮细胞中产生，也在肾小球系膜和肾小管上皮细胞中产生。ET-1 的肾脏作用包括增加肾血管阻力和降低肾小球滤过率和肾小管钠处理改变，导致尿钠排泄和利尿。
一氧化氮 (NO) 是一种重要的信号分子，通过调节不同体积的生理和细胞过程在众多组织中具有活性。它的作用首先由几组研究人员发现，他们试图确定负责促进血管舒张和调节血管张力的药剂。[4,5] 该药剂被命名为内皮衍生舒张因子，最初被认为是一种蛋白质，大多数其他信号分子也是如此。细胞内NO合成可能受多种方法调控，如细胞NO分布、NO基因表达的改变、酶活性和细胞NO活性抑制剂的存在[4,5,6]在众多病理条件下，NO的作用是取决于疾病的发生地、NOS 的参与以及其他肾内因素的存在与否。NO 的作用在几种病理性肾病中是特殊的，例如急性肾功能不全、炎性肾炎、糖尿病肾病和移植排斥 [6]。尽管 NO 最初被描述为一种趋化因子血管扩张剂，但它在血管生物学中发挥着重要作用，具有抗血栓形成、抗炎、抗增殖和抗氧化作用[6,7]， 代表了所有三种 NO 亚型在肾脏的各个部分。eNOSis 大量存在于肾微血管系统、肾小球内皮细胞、近端肾小管细胞、Henle 袢的薄升支和集合小管中。大量研究证实，NO 调节大血管和微血管作用，包括肾小球血流动力学。NOS 抑制降低了基础肾血流量，同时保留了自动调节机制。肾内 NO 调节音调和传入和传出小动脉。[7,8] NO 对肾流量和电解质转运的影响是对肾血流动力学、肾神经和直接肾小管转运特性的净效应的结果。[8,9,10 ]
本研究旨在检查 ESWL 治疗的肾结石患者血清中 NO 和 ET 水平变化的存在、特征和程度，并确定 NO 和 ET 浓度变化之间是否存在相关性。ESWL 治疗前患者的血清和血管肾元素变化的发生、特征、程度和定位。该研究的目的还在于调查 NO 和 ET 是否与施加的冲击波和施加的能量数量直接相关。
患者和方法
该研究包括萨拉热窝大学临床中心泌尿科诊所的 60 名患者，为期 3 年。入选标准如下：18岁以上肾结石患者（肾结石最大直径20mm，X线必须可见结石），首次ESWL治疗（新发病例），单侧碎石治疗，既往未接受肾脏手术，没有膀胱下梗阻，没有证实的尿路感染，重复使用一种和相同的镇痛药，没有抗凝治疗，没有抗高血压治疗，治疗前和治疗期间没有使用肾毒性药物，血压正常，一般标准——非妊娠患者，肾功能正常的患者。排除标准为：直径大于20mm的肾结石、急性泌尿系感染和全身炎症、尿路梗阻引起肾积水、先天性肾脏或输尿管畸形患者、双侧ESWL治疗、尿石症复发病例、输尿管结石、过去3个月血肌酐>350 μmol/L，高血压，服用降压药，糖尿病，既往肾脏手术，一般标准——妊娠患者，肾功能受损患者，未签署知情同意书。
治疗的肾结石仅位于肾盂 (14)、上 (11)、中 (16) 和下肾盏 (19)。受试者被分为两组：第一组（n = 24），其中总共管理了 2000 个 SW；0-2 个单位；（每 500SWs 0.5 个单位）和组 II（n = 36），其中总共管理了 4000SWs；0–4 个单位；（每 500SW 0.5 个单位）。在 ESWL 处理前、30、60 分钟和 24 小时后采集用于测定 NO 血清浓度的样品，并立即在-20°C 的温度下冷藏待分析。
对冷藏血清样品进行脱蛋白，以便将 0.05 ml 30% ZnSO4 溶液添加到 1 ml 样品中。几分钟后，将样品以 700 g 离心 10 分钟，然后将分离的上清液在 -20 °C 下冷藏，等待 NO32- 浓度的测定。通过测量全血中的 NO32- 和 NO22- 浓度来确定 NO 浓度。通过使用元素锌将 NO32- 转化为 NO22-，然后通过比色制备的 Griess 试剂（由磺胺和 N-1-萘基乙二胺组成）测量 NO22- 浓度来确定浓度。在室温下振动器搅拌 10 分钟后，通过 546 nm 滤光分光光度计测量光吸收（光密度）。NO22− 浓度从标准曲线中呈红色，已知 NaNO3 浓度（1.56–100 nM）。添加 Griess 试剂的蒸馏水用作盲试运行。同样的程序用于直接测定 NO22-，唯一的区别是没有添加元素锌。用于确定 NO 水平的血清样本是在碎石科泌尿外科诊所采集的，而分析本身是在萨拉热窝大学临床中心实验室和萨拉热窝医学院生理学和生物化学研究所进行的。在 ESWL 治疗后的第 3 天和第 7 天，在碎石科泌尿外科诊所采集用于测定 ET 浓度的血清样本。样品在-20°C冷藏，等待测量。ET 1 KIT，IBL Hamburg，标准ELISA方法用于确定ET浓度。结果经过统计学处理，因此对于每组受试者，确定平均值 (Mean)、标准偏差、平均值的标准误差、中值 (MED) 和百分比差异 (P10、25、75 和 90%)。使用Student's t-test (p)测试各组受试者平均值差异的显着性，如果不能使用，则使用Mann测试MED差异的统计显着性惠特尼-威尔科克森检验。P <0.05的值被认为具有统计学意义。对于受试者的某些比较组数据，确定了Pearson相关系数（r），相同的显着性水平（r - p）和显着性水平P <0.05的相关水平（r1 - r2）。从萨拉热窝大学临床中心伦理委员会获得伦理批准。
结果
在接受 2000 SWs 治疗的受试者 (n = 24) 中，在 ESWL 治疗后的第 1、3 和 5 天，ET 血清浓度增加 (3.48 ± 1.17)、(3.38 ± 0.68)、(3.40 ± 0.74) 与 pre -治疗水平 (3.27 ± 0.36 pg/ml)，增加不显着 [表 1]。在接受 4000 SWs 治疗的受试者组 (n = 36) 中，ET 血清浓度显示出不同的运动。相对于治疗前水平 (3.20 ± 0.47 pg / ml)，在 ESWL 治疗后第一天，ET 血清浓度显示出不显着的下降 (3.16 ± 0.48)，而在 ESWL 后的第 3 天和第 5 天，浓度增加分别与治疗前水平 (3.24 ± 0.63) 和 (3.22 ± 0.28) 相比，增加不显着 [表 2]。在接受 2000 次 SW 治疗的受试者 (n = 24) 中，与治疗前水平 (39.04 ± 8.29 μmol / L) 特别是治疗后 30 分钟、60 分钟和 24 小时 (39.11 ± 12.60) 相比，血清 NO 中值浓度增加， (41.80 ± 6.89) 和 (46.33 ± 9.03)，其中 24 小时后的浓度增长具有统计学意义 P <0.01 [表 1]。在 30 分钟 (48.71 ± 30.09)、60 分钟 (54.57 ± 39.76) 后，接受 4000 SWs 治疗的受试者组 (n = 36) 中的 NO 血清浓度与治疗前水平 (38.90 ± 10.33 μmol/L) 相比增加和 24 小时 (97.95 ± 72.07) [表 2]。60 分钟和 24 小时后 NO 浓度增加具有统计学意义，P <0.03 和 P <0.0001。两组NO血清浓度比值见图1。
表格1 2000 SWs 后内皮素和一氧化氮变化的统计指标，如在体外冲击波碎石治疗后的患者中测量的
表 2 体外冲击波碎石治疗后受试者测量的 4000 SW 后内皮素和一氧化氮变化的统计指标
图1 接受 2000 SW 和 4000 SW 治疗的受试者的一氧化氮血清浓度比较（30 分钟后 [30 分钟]、60 分钟后 [60 分钟]、24 小时后 [24 小时]）
讨论
观察ET变化，关于体外碎石术与血清和尿液浓度变化之间关系的文献只有两篇报道。本研究中也存在 ESWL 治疗后 ET 血清水平的增加，但不显着，时间函数和施加的冲击波数量没有直接相关性。这些数据并未证实与 ET-1 相关的假设 1 部分。斯特罗迈尔等人。得出的结论是，ESWL 对 ET 血清浓度运动没有显着影响，因此不会引起显着的肾损伤[11]。同年，Kirkali 等人。声称 ESWL 治疗后 ET-1 血浆浓度显着增长，而在尿液中这种增长不显着，这意味着在这种治疗后释放的 ET 会引起肾脏的血流动力学变化[12]。同一项研究表明，使用钙通道阻滞剂进行药物预防可以防止 ET 浓度增长。[12] NO，高效血管扩张肽是通过内皮 NOS 酶促产生的，通过平滑肌肉组织的血管细胞调节血管舒张，并拮抗血管紧张素 II 在传入小动脉中的血管收缩作用，有助于调节肾血流量、肾小球滤过和 Na 稳态。NO 还参与血流的自动调节、肾素分泌、系膜肾小球和上皮细胞的活动以及肾小管功能。虽然一些作者对 NO 的有害影响感兴趣，但已经清楚地证明，在肾缺血期间 NO 的产生会增加。在这项研究中，在治疗后 30 和 60 分钟和 24 小时监测 NO 血清浓度运动。在 ESWL 治疗组的患者中，随着 2000 次 SW 的给药，浓度水平增加，只有 24 小时后增加，才具有统计学意义（P <0.012）。在接受 4000 次 SW 治疗的患者中，NO 血清浓度在所有三个时间类别中均增加，但在 60 分钟后（P <0.033）和 24 分钟后（P <0.001）显着增加。鉴于所获得的 NO 血清浓度结果显示出一定的规律，预计 24 小时后的浓度将呈现稳定趋势并恢复到治疗前的水平。
在他们 2003 年的研究中，Sarica 等人。监测了 NO 和肾上腺髓质素血清和尿液水平的变化，并得出结论，这两个测试参数的水平在治疗后 24 小时增加，并且增加与施加的冲击波的数量成正比。治疗后 7 天，数值又回到治疗前的水平[13]。帕克等结论是 ESWL 在治疗后立即、30 和 60 分钟后升高了 NO 血清水平，并且升高是显着的。在设定的时间参数内没有尿液增加不显着。环状 3', 5' 鸟苷单磷酸作为 NO 代谢物，在设定的时间类别内治疗后增加，并且增加是显着的。阿克索伊等人监测 NO 和丙二醛血浆和尿液运动，目的是确定这些类别的 ESWL 治疗后变化，以及究竟是什么导致 ESWL、张力、空化热效应或自由基形成的不利影响。在所有设定的时间参数期间，NO 血浆和尿液水平相对于预处理值显着增加。丙二醛血浆水平的增加也很显着，而尿液水平的增加不显着。在他们的论文中，作者推测 ESWL 治疗会触发由肾缺血和再灌注过程引起的氧化应激。NO 产生的增加被解释为预防血管收缩引起的肾损伤。ET 和 NO 值可以作为早期实质损伤和肾动脉循环损伤的指标，并允许临床医生及时进行治疗和诊断。
结论
冲击波可能通过干扰内皮 NO 的产生或刺激血管活性物质的释放来影响肾血流动力学，例如 NO 和 ET，非常有效的血管扩张剂或血管收缩剂，其血清水平在设定的时间段内受到监测，是 ESWL 治疗引起的细胞水平损伤的非常敏感的指标。根据研究结果，已经清楚地证明，在 ESWL 的影响下，NO 和 ET 血清水平发生变化，并且 NO 和 ET 的变化与施加的冲击波次数和施加的能量直接相关。