胃癌分子分型的研究进展

本文原载于《中华胃肠外科杂志》2016年第9期

胃癌是世界范围内第4位最常见的恶性肿瘤，现今临床上普遍使用的分型仍为Lauren分型或WHO分型。虽然组织病理学分型在治疗决策及预后预测方面具有一定的参考价值，但在日益提倡癌症个体化治疗与精准医疗的时代，传统的组织病理学分型已无法满足反映肿瘤的内在特性，以及指导早期诊断和个体化治疗的需要。这一现状使医生为胃癌患者选择治疗方法的依据极为有限，难以大幅提高胃癌的治疗效果^[1]。随着基因芯片、二代测序和高通量分析技术的发展，对于胃癌的研究得以深入至分子水平。胃癌驱动基因的发现和发病机理的阐明，可进一步推动胃癌临床诊疗的发展，促进新的生物标记物及潜在的治疗靶点被发现，新型的靶向药物应用于临床。ToGA研究作为单基因指导治疗在胃癌领域成功应用的范例，提高了人类表皮生长因子受体2(human epidermal growth factor receptor 2， HER-2)过表达晚期胃癌以及胃食管结合部腺癌患者的疗效^[2]。随着'精准医学'观念的提出与普及，从分子水平重新认识疾病、早期诊断，应用分子分型指导治疗、预测预后，已成趋势。本文将从分子水平综述近年来胃癌分型的研究进展，以期为临床应用提供参考。

一、胃癌的分子特征

胃癌是一类具有高度异质性的肿瘤，其发生因素多样，不同地区治疗方式各异，不同解剖部位、不同组织学类型肿瘤表现出差异化的生物学行为。自1923年胃癌大体分型Borrmann分型的出现，至1965年Lauren分型的提出，学者们一直尝试从不同角度对胃癌进行亚型分类。2010年，美国的Shah等^[3]根据组织类型、解剖部位、环境、遗传和流行病学特征，将胃癌分为非贲门胃癌、弥漫型胃癌和非弥漫型近端胃癌。韩国的Lee等^[4]通过对已知驱动基因的统计分析，发现胃癌患者中HER-2扩增者占22%，成纤维母细胞生长因子受体(fibroblast growth factor receptor，FGFR)扩增者占6%，肝细胞生长因子受体(hepatocyte growth factor receptor，HGFR，又称c-Met)扩增者占2%，表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor，EGFR)扩增者占2%，K-ras扩增者占9%；PIK3CA突变者占22%，HER-2突变者占5%， K-ras突变者占4%，BRAF V600E突变者占2%，除此之外，还存在35％驱动基因不明的胃癌患者。上述研究提示胃癌具有高度异质性，这种异质性导致了目前各种单一的分型均无法很好地概括胃癌生物学特征，亦导致了其分子分型的复杂性以及分类依据的选择差异。

目前关于胃癌分子特征的研究主要包括如下方面：(1)基因突变：胃癌的基因突变主要发生在与以下功能相关的基因：TP53、BRAC2等基因组稳定性相关基因^[5,6,7]；ARID1A、ARID1B、PBRM1和SMARCC1等染色质重塑相关基因^[8,9,10]；FAT4、CDH1、CTNNA1和RHOA等细胞粘附、细胞骨架和细胞运动相关基因^{[8,11,12,13,14]}。(2)肿瘤发生相关信号通路异常：如Wnt信号通路^[15,16]、RTK相关通路^[17]和PI3K通路^[18]。(3)染色体不稳定：如体细胞拷贝数变化(somatic copy-number alteration，SCNA)与基因扩增，染色体易位、扩增、重排，以及杂合性丢失(loss of heterozygosity，LOH：高LOH者与肠型或混合型胃癌相关，低LOH者与弥漫型胃癌相关)^[19,20]。(4)转录组学：微阵列、RNA测序技术的发展，有助于对胃癌基因表达、基因扩增的分析，用于胃癌的诊断、预后预测及分子分型等。(5)表观遗传学：DNA错配修复基因(mismatch repair，MMR)或抑癌基因启动子CpG岛胞嘧啶甲基化导致的转录失活，CpG岛甲基化表型(CpG island methylation phenotype，CIMP)，以及组蛋白修饰。(6)微卫星不稳定(microsatallite instability，MSI)：MSI型胃癌与微卫星稳定(microsatallite stability，MSS)型相比，染色体畸变的发生率更低^[21]。错配修复基因hMLH启动子区域的高甲基化使DNA损伤修复机制失调从而导致MSI表型^[22]。依据MSI的情况可将胃癌分为高MSI(MSI-H)型、低MSI(MSI-L)型和MSS型，且MSI-H型较MSI-L型和MSS型具有更好的预后^[23,24]。

二、胃癌的分子分型

进入本世纪后，已有较多研究尝试对胃癌进行亚型分类，但存在样本量较小或作为分类依据的分子特征不够全面等问题。例如，Tay等^[25]运用比较基因组杂交(comparative genomic hybridization，CGH)、MSI特征和基因表达微阵列技术分析了60例胃癌样本，将胃癌分为3种亚型：(1)成瘤型(tumorigenic)；(2)反应型(reactive)；(3)胃样型(gastric-like)。Chen等^[26]运用cDNA微阵列技术分析了90例胃腺癌、14例淋巴结转移癌和22例正常胃组织，检测了约30 300个基因的表达情况，发现了在癌组织和正常组织中具有差异的基因表达模式，并将胃癌分为两类：(1)肠样型(intestinal-like)；(2)胃样型(gastric-like)。近5年来，随着样本量的扩大，纳入分型依据的增多以及分析方法的完善，胃癌的分子分型日臻成熟与完善，以下介绍几种目前较为完善的分型系统。

1．Tan分型：

2011年新加坡的Tan等^[27]分析了37株胃癌细胞系的基因表达情况，将胃癌分为2种亚型：(1)基因肠型(G-INT)。(2)基因弥漫型(G-DIF)。作者用来自新加坡和澳洲的独立队列共152例患者对该分型进行验证，发现G-INT型的预后明显优于G-DIF型(HR=1.79, 95% CI： 1.28~ 2.51，P=0.001)，而Lauren分型则与预后不相关(P=0.23)。当Tan分型与Lauren分型不符时(即患者为G-INT型且Lauren弥漫型胃癌，或G-DIF型且Lauren肠型胃癌)， Tan分型依旧表现出了与预后的显著相关性(P=0.04)。此外作者进行了体外药敏试验，发现G-INT型对氟尿嘧啶(5-FU)和奥沙利铂敏感，而G-DIF型对顺铂敏感，且Tan分型与以5-FU为基础的术后辅助化疗方案获益存在显著交互作用(P=0.002)。以上研究提示，Tan分型具有预测预后和指导用药的潜力。

2．Lei分型：

2013年Lei等^[28]根据基因表达、药物敏感性等特征对248例胃腺癌进行分型，获得了3种亚型：(1)间充质型(mesenchymal subtype)：含有肿瘤干细胞样特征的细胞，对PI3K-Akt-mTOR信号通路抑制剂敏感。研究发现针对PI3K-Akt-mTOR通路的靶向药物可能对部分间充质型胃癌有效。(2)增殖型(proliferative subtype)：基因组不稳定， TP53基因突变，DNA低甲基化。(3)代谢型(metabolic subtype)：对5-FU敏感。与2011年的Tan分型相比，Lei分型系统增加了第3种分型(代谢型)。Turner和Turner^[29]认为这与研究者在层次聚类分析时需要预先设定集群数有关。Lei分型系统中，间充质型有60％为Lauren弥漫型，增殖型有75%为Lauren肠型。Lei等^[28]围绕'术后是否应用5-FU方案辅助化疗'对来自新加坡和澳洲的患者进行了预后分析，发现间充质型和增殖型胃癌患者的预后较差，而代谢型患者预后较好，提示代谢型患者对5-FU敏感。

3．TCGA分型：

2014年《Nature》发表了癌症基因组图谱(the cancer genome atlas，TCGA)计划工作中一项有关胃癌分子分型的研究^[30]。该研究入组了295例未接受过术前治疗的原发性胃癌患者，77％样本的组织和血液标本进行了6种分子平台的检测，全部样本DNA进行了MSI检测，107例样本进行了低通量全基因组测序。通过无监督聚类和应用iCluster的综合聚类分析，该研究提出了含有4类亚型的分型系统：(1)EB病毒(EBV)阳性型：约占9%，好发于胃底和胃体，多见于男性。该型的特征包括致癌基因PIK3CA频发突变、程序性死亡受体PD-L1和PD-L2过表达、DNA超甲基化(EBV相关的CIMP)和激酶JAK2、CD274和PDCD1LG2基因扩增；(2)MSI型：约占22%，好发于胃窦或幽门，多见于女性(56%)，初诊年龄偏高(中位年龄72岁)。该型的特征是高突变率、MLH1超甲基化(MSI相关的CIMP)。(3)基因组稳定(genomically stable，GS)型：约占20%，初诊年龄偏低(中位年龄59岁)，多属Lauren弥漫型(73%)。该型有CDH1和RHOA的突变以及CLDN18-ARHGAP融合现象。(4)染色体不稳定(chromosomal instability，CIN)型：约占50%，多发生于胃食管交界处和贲门(65%)，多属Lauren肠型。该型具有标志性的异倍染色体和受体酪氨酸激酶(receptor tyrosine kinases，RTK)原位扩增。

胃癌TCGA分型的确立具有里程碑式的意义，但仍有其局限：(1)虽然该分型在东西方之间没有发现系统性差异，但针对不同人种与地区的差异无法评估；(2)亚洲人群所占比例偏低：入组人群中日本与韩国共75例，仅占25.4%；(3)纳入的病例皆为局部进展期胃癌，结论能否外推至转移性胃癌无法确定；(4)TCGA队列的病例中位随访时间仅为362.5 d，缺乏长期的临床随访数据，未能确定分子特征与复发和预后的关联。

4．ACRG分型：

2015年《Nature Medicine》发表了一项由亚洲癌症研究组织(Asian Cancer Research Group，ACRG)发起的胃癌分子分型研究，共纳入300例患者^[31]。该研究对获得的数据进行了主成分分析(principal component analysis，PCA)，并将前3个主成分与一系列基因特征进行关联，获得了一个新的分型系统，包含如下4种亚型：(1)MSI型：75％以上发生在胃窦，超过60％为Lauren肠型，50%以上处于较早的分期(Ⅰ或Ⅱ期)；(2)MSS／上皮间质转化(EMT)型：发病年龄较其他亚型显著偏低，超过80％为Lauren弥漫型，细胞粘附基因CDH1表达缺失，且分期较晚，多为Ⅲ～Ⅳ期；(3)MSS/TP53+型：EBV阳性率较其他亚型高；(4)MSS/TP53-型。该研究进行了分型与预后的相关性分析，ACRG分型在研究本身的队列人群中表现出了与预后较强的关联性(P=0.0004)，总体预后趋势为：MSI型最好，MSS/TP53+型次之，接着是MSS/TP53-型，MSS/EMT型预后最差。除此之外，作者按照ACRG分型对之前报道的3个独立的队列人群[SMC-2队列(277例)，新加坡队列(200例)以及TCGA胃癌队列(205例)]进行预后分析，结果同样表现出了与预后较强的关联性(P值分别为0.0004、0.01和0.04)。在此基础上，对外来的3个队列加上ACRG队列进行合并分析，亦得到了有意义的结果，由此证实了ACRG分型在预后方面良好与稳定的区分度。除此之外，作者利用SMC-2队列和ACRG队列研究了分子分型与复发的关系，发现MSS/EMT型较MSI型有更高的复发率(63％比23%)，且最初复发的部位与分子分型相关，表现为：(1)网膜种植发生率：MSS/EMT型为64%(41/64)，高于其他亚型(23%， 39/172)；(2)局限性肝转移：MSI型为23%(6/26)，MSS/TP53-型为21%(18/85)，均高于MSS/EMT型(4.6%，3/64)和MSS/TP53＋型(8%，5/61)。

在上述研究的基础上，作者将ACRG分型与TCGA分型进行了一系列的对比，发现两个分型系统中MSI亚型的符合程度较高，其余亚型则无法很好地进行对等。显然，这两个分型系统无法互相取代。ACRG分型相较于TCGA分型获得了更好的临床转归关联结果，且其样本来源于亚洲人群，因此，ACRG分型对于中国的胃癌患者更具临床意义。

三、胃癌分子分型的应用与存在的问题

目前胃癌分子分型临床应用主要包括以下几个方面：(1)早期诊断：胃癌的发生发展包含多个阶段，研究正常胃黏膜、肠化、异型增生以及胃癌组织中差异表达的基因，可以从分子水平了解正常黏膜向胃癌的演变机制，寻找各阶段的标志性基因特征，从而对高危人群进行监测和早期诊断^[32]。例如，利用RNA测序技术发现AMPKα-HNF4α-WNT5A通路在早期胃癌中上调，从而有望成为早期胃癌的诊断标志^[33,34]。(2)指导治疗：分子分型可以进行疗效预测并筛选出对某种治疗方式敏感的目标人群，从而真正实现个体化的治疗。上述Tan分型和Lei分型中的不同亚型，对特定的细胞毒药物及分子靶向药物具有不同的敏感性。(3)新型靶向药物研发：根据各类分子分型的亚型特征指导靶向药物的研发与应用，有望改善目前胃癌有效化疗药物少、靶向治疗滞后的局面。例如，TCGA分型中的EBV阳性型患者，具有PI3KCA基因突变频率高、CDKN2A基因高甲基化与PD-L1基因扩增的特点，能够成为PI3K抑制剂、CDK4/6抑制剂和免疫治疗的靶向人群。(4)预后预测：前述的多个研究已初步开展了预后预测工作，包括通过获得的基因表达数据建立预后预测模型，或对分子分型各亚型与预后的关联性研究等。但是就胃癌而言，目前仍停留在做出分型这一步，分子分型在临床中的应用程度有限。

然而，随着胃癌分子分型的研究不断深入，相应的问题也随之而来：(1)东西方人群胃癌的差异：来自不同地区的分子分型研究存在一定区别，例如EBV阳性率、MSI所占比例等各有所不同。因此，对于胃癌这一具有区域特征的肿瘤，还需要更多的研究和数据，顾全总体的同时也需针对不同人群。(2)信息提取分析难度高：各类研究所产生的海量生物信息，构成了一个庞大的网络，需要与临床资料加以整合，才能获得应用并指导临床，这对于数据库的构建、利用与信息共享等方面提出了极高的要求。(3)肿瘤基因在治疗过程中会发生动态的变化：当下的研究，大多仅在某个单一的时间点进行检测，获取的信息无法反映肿瘤基因的动态变化(如发生耐药)。多个时点的活检在临床上的可行性较低。而近年液体活检技术的兴起可能是解决这一问题的方法。

综上，胃癌是一种异质性很强的肿瘤，一系列复杂的驱动基因以及外部环境因素在其发生发展过程中扮演着重要的角色。尽管目前分子分型在胃癌治疗的临床应用程度有限，其在胃癌的个性化诊疗方面仍具有巨大的潜力。未来的研究应从功能与临床应用的角度，研究目前已获得的各类数据，同时结合环境因素与肿瘤微环境等方面进一步阐明胃癌的本质，从而实现真正的临床应用，指导个体化的诊断、治疗与预测。

参考文献（略）

（收稿日期：2015-11-12）

（本文编辑：朱雯洁 ）