慢病毒载体的使用风险评估

除了需要识别LV本身固有的危害外，还需要对载体使用过程中的风险进行彻底的评估。典型的实验室操作规程包括：（1）操作和处理LV转染细胞实验室，（2）LV悬浮处理，（3）体内实验，包括接种LV悬浮液或者LV转染细胞的实验动物，（4）载体的制备。必须确定每一个过程中暴露的风险，特别注意的是体内试验或在非确定是否存在内源性逆转录病毒学列的细胞培养中，对于宿主的意外污染。

5.1 处理LV转染的细胞实验室

如果没有合适的培养条件，动物细胞的生存期都是有限的。因此，转染细胞体外操作最主要的生物危害就是实验室工作和意外接种的可能性。在细胞基因族中LV的整合，这可能有插入突变或转录的邻近基因以及外源基因稳定表达的风险，有可能促进细胞生命周期延长，增加肿瘤形成的风险，以及其他有害的影响。然而，在宿主生物体中，LV转导细胞接种这些假定的有害影响的真实程度是很难预测的。转导的细胞和宿主生物之间的组织相容性不匹配仍然是它们生存和扩张的主要障碍，因为在非免疫缺陷的宿主内他们通过免疫反应排斥转导细胞的识别和破坏。这也是为什么严格控制那些个人实验室培养细胞的主要原因之一。

5.2 LV的悬浮处理

LV悬浮液的处理，尤其是高浓度，提高实验室工作人员意外感染的可能性，因此被认为是与高风险相关的活动。主要的潜在危险是研究人员通过注射耗材接种（如针头）感染，因为偶然感染后后，LV可能会整合到受感染的宿主细胞基因组中。这不仅能产生基因插入激活或者转录激活的危害，也可能导致转染基因的永久表达，产生有害的基因产物。尽管转基因的风险不在本次审查中涉及，但它们仍然是需要认真考虑的一个重要因素。特定类别的基因，包括癌基因、细胞因子的编码基因和病毒基因，本质上就是具有高风险的。由LV引入的介导基因沉默的shRNA也可以敲出抑癌基因。鉴于潜在的转基因或sh-RNA种类繁多，LV携带转基因风险评估仍然是个别案例个别处理的方法，需要进行更仔细的分析。

5.3 体内试验

当意外或者特意感染LV的宿主，载体序列和宿主体内存在的野生型病毒的衍生序列仍然存在着重组的理论风险，这可能会产生不良的影响。例如，在动物模型体内试验发现，在长臂猿白血病病毒-MLV衍生的逆转录病毒载体和牛白血病病毒（一种复杂的感染白血病的牛和羊逆转录病毒）之间的重组有直接的危害。

在小鼠模型中使用HIV衍生的LV可以避免潜在的野生型啮齿类病毒的风险，防止HIV感染。此外，一些研究证明在宿主系统中γ-逆转录病毒的存在几乎没有不利的影响。γ-逆转录病毒和慢病毒之间的交叉包装还没有在培养的细胞中发现，甚至在携带HIV病毒基因组的转基因小鼠中的每个细胞中也没有发现，对组织进行Southern blot分析也没有检测到自由的HIV前病毒序列的存在。在体内异种移植系统产生有复制能力的慢病毒的潜力也被调查。通过对慢病毒转染人造血干祖细胞移植的149只免疫缺陷小鼠进行风险评估发现，两只之间没有明显的相关性，并且通过几个月的观察，也没有在他们的血清中检测到HIVp24抗原。然而，尽管这些“令人放心”的发现，作者强调，与这种有限的小鼠研究相比，进行长时间体内评估是必要的。

特别要注意的是当宿主被慢病毒感染的时候，因为这将增加慢病毒载体动员或者互补的风险，从而增加RCL形成的潜在可能。如前所述，在使用LV的第一个临床试验结果显示，在慢性HIV感染的病人中存在慢病毒载体序列的动员。另一个问题就是那些经过基因治疗获得HIV感染的病人中LV的动员。

5.4 内源性逆转录病毒序列

用于载体制备和携带LV的特异性靶向细胞的包装细胞系可能会引起宿主细胞中或者包装细胞中存在的内源性逆转录病毒序列的相互作用。ERV是古老种系中外源性逆转录病毒整合到基因组上残留下来的。有些可能通过逆转录转座子已经进入宿主的基因组中。通过各种机制如重组和转录激活，一些ERV可以和外源性的逆转录病毒相互作用这已经被证明了，外源性的逆转录病毒就包括了逆转录病毒载体。在逆转录病毒载体介导的反式作用蛋白也能导致其他非内源性逆转录病毒动员，或ERVS包装会导致不必要的序列转移到靶细胞，与逆转录病毒载体或者细胞内基因组发生重组。同样，LV在临床试验中使用也需要考虑人类内源性逆转录病毒的存在的相关潜在风险。HERVs使人类内源性序列与病毒载体之间的重组的理论性可能高达8%。

通过体外研究小鼠白血病病毒（MLV）在载体颗粒中HERVs的掺入暗示因为MLV包装机制，还存在着HERVs的无意识别和包装。从最近的一项研究表明，HIV-1衍生的LV系统与HERV序列包装程度小于MLV系统。这个作者对这一现象进行了部分解释，在人类基因组中不存在逆转录病毒相关HERVs，但是却存在着相当数量的MLV相关的HERVs序列。不过，在易感细胞被HIV感染后，一些HERVs是存在被HIV Rev识别的序列的，这样才能促进HERV复制子的出核。此外，在HIV-1感染的患者血浆中检测到了HERVs的RNA，这个结果支持了重要蛋白对内源性逆转录病毒依然存在编码能力和激活潜力这一观点。HERVs包装的HIV与释放HIV RNA的比例仍然是不清楚的，但是不同形式的细胞应激可以诱导HERVs非特异性表达这是公认的。然而，最近的研究表明，HERVs是功能性慢病毒序列与HIV衍生LV重组的原因，这是需要我们解决的。

目前对于人类基因治疗建立一个LV安全生产系统还太早。一些LV的临床试验还在进行，还需要进一步随访观察产生的不良影响。自从第一次使用LV靶向人类T淋巴细胞进行HIV感染（例如，抗HIV RNAs的表达）或者癌症的治疗以来，最近LV介导的基因治疗已经发展到靶向自体CD34+造血干细胞/祖细胞，以进行脱髓鞘疾病治疗，这些疾病包括肾上腺脑白质营养不良血红蛋白病或者干细胞缺陷如镰状细胞性贫血，地中海贫血或威-奥德里奇综合征。这些临床试验的结果将会给我们提供更多关于LV临床适用性和安全性的有价值的信息。