过表达慢病毒载体构建步骤及过程

在进行基因功能研究时，开展“加法”实验是常用的科研思路。构建过表达稳转细胞株可有效实现基因的上调，其中慢病毒转染是最常用的构建方法，可达到长效稳定的调控效果。今天就向大家介绍慢病毒过表达载体的构建。首先，我们要确定目的基因序列，即目的基因的转录本。然后根据实际需求选择合适的慢病毒载体骨架和相应的元件。下面通过一个常规的慢病毒载体骨架来介绍不同元件的特点（图1）。

图1. 慢病毒过表达载体启动子：位于基因5’端上游，能活化RNA聚合酶，使其与DNA准确结合并开启转录。在常规的过表达实验中，我们可以考虑一些常用的启动子，如CMV、EF1α和CAG启动子等，这些启动子具有强驱动活性和广谱适用的特性。CMV特别适合肿瘤细胞、肌肉、肝脏等体细胞或者贴壁细胞的基因表达；EF1α启动子特别适合干细胞、原代细胞、造血细胞等的基因表达；而CAG启动子特别适合免疫细胞和体细胞中的基因表达。如果需要保证组织特异性，那么可以灵活使用组织特异性的启动子，更好地驱动目的基因在特定的组织或细胞中表达。如CaMKIIa和hSyn等可以在神经元中特异表达；Afp、Alb和Tbg等可以在肝细胞中特异表达（表1）。组成型启动子特点特异性启动子特点CAG强，广泛表达，序列较长CaMKIIa神经元特异性，高表达CMV强，广泛表达，常用hSyn神经元特异性，高表达EF1α广泛表达Afp肝细胞表1. 慢病毒载体常用启动子（部分）荧光标签与筛选标记：荧光标签用于检测载体的表达效率。常用的荧光标签有GFP、EGFP和mCherry等（表2），可以根据实际的实验情况进行选择。需要注意的是，如果实验中需要Luciferase时则最好不再选择EGFP。将两者放在同一个慢病毒载体时，Luciferase或EGFP有其一不能正常观察到荧光。筛选标记用于筛选去掉无抗性的细胞。通常有真核抗性和原核抗性，真核抗性有Puro、Neo、Hygro、BSD等；而原核抗性有Amp、Kan，用于细菌培养质粒扩增。荧光蛋白荧光特点GFP绿色荧光EGFP增强型，EGFP的6倍copGFPEGFP的1.3倍mNeonGreen新型黄绿色mCherry红色dTomato红色表2. 常用的荧光标签5' LTR与3' LTR：5' LTR与3' LTR之间的序列是整合至宿主基因的，因此是目的基因插入的区域。需要注意的是目的基因不能过长，超过9 Kb会降低慢病毒的滴度。并且基因不建议构建反向表达，反向表达会影响病毒滴度。还需注意的是5' LTR与3' LTR之间建议不加polyA，由于HIV是逆转录病毒，加polyA会影响病毒转录。其他元件：其他的元件的作用主要是提高慢病毒的包装效率、滴度和目的基因的表达效率等。如Ψ提供病毒所需的包装信号；RRE在病毒包装过程中允许病毒RNA通过病毒Rev蛋白的核输出；CPPT增加病毒基因组的核输入，提高载体整合到宿主基因组中的效率，从而提高转导效率；Kozak促进真核生物的翻译起始；WPRE增强病毒RNA在包装细胞中的稳定性，使包装病毒的效价更高；T2a作为连接子，连接上下游两个游两个基因，在翻译后T2a会断裂，断开所连接的两个蛋白；SV40 early pA促进包装过程中的转录终止，提高病毒滴度。选择好符合实验需求的启动子、荧光标签和筛选标记等元件后，下一步则是获取带有酶切位点的目的片段。可以通过直接合成或PCR扩增获得。直接合成法是根据目的基因的序列直接合成；PCR扩增法是提取目的基因高表达样品的RNA，然后以反转录得到的cDNA作为模板，设计相应的引物扩增获得目的片段。接着便可以将目的片段连接至载体中。酶切带有酶切位点的目的片段与载体骨架，然后通过连接酶将两者连接形成带有目的片段的重组载体。将重组载体转化至感受态细胞中并扩增重组载体，再经过测序确认重组载体构建无误。最后包装成慢病毒，将重组载体和3个用于病毒包装的辅助质粒共转染至293T细胞中，转染后通过观察荧光确认转染效率，超速离心收集慢病毒所在的上清液并过滤，接着用PEG-NaCl浓缩，通过蔗糖垫纯化慢病毒，最后进行滴度测定和无菌检测等。使用质粒法过表达外源基因具有简便、成本低和实验体系成熟等优点，因此大多数实验室会偏向于使用质粒法。但是对于有特别需求的过表达实验，如难以转染的细胞、需要稳定遗传目的基因和需要极高的转染效率等，那么质粒法则难以满足我们的需求。这时候用慢病毒法往往可以得到更好的实验结果。下面再详细介绍在构建过表达载体时慢病毒法相对于质粒法的优势：1. 外源基因能稳定整合与表达。质粒法过表达外源基因只能实现瞬时过表达，外源基因会随着宿主细胞的分裂传代而不断丢失。而慢病毒法则是将外源基因整合至宿主的细胞中，因而会随着宿主细胞的分裂传代而稳定遗传。2. 高效的转导效率。由于受到较多因素的影响，质粒法的转染效率往往不高。这些因素如细胞类型、电转参数、质粒大小和质粒大小等。而慢病毒法则可以包装出滴度极高的慢病毒，并且慢病毒的VSV-G蛋白具有广泛的亲和性，几乎能感染所有的哺乳动物细胞，因此慢病毒法有极高的感染效率与转导效率。3. 基因拷贝数相对均一。由于质粒法转染获得细胞的拷贝数往往是不均一的，会出现部分细胞拷贝数高，部分细胞拷贝数低甚至没有，这就造成了目的基因在不同细胞中的表达量存在差异，使得各个细胞的遗传表型存在差异。而慢病毒转导所获得的细胞的基因拷贝数相对均一。