dCas9-ROS1——靶向去甲基化的捷径

哺乳动物利用10-11易位蛋白（ten-eleven translocations,TETs）氧化5mC以实现DNA去甲基化，但是该过程会产生不同的修饰，如：5-羟基，-甲酰基和-羧基胞嘧啶（5hmC，5fC，5caC），这可能是它们自身独特的表观遗传状态。另一方面，植物已经进化出了一种更直接的去甲基化途径，即利用DNA糖基化酶REPRESSOR OF SILENCING 1（ROS1），该酶直接以5mC为靶向，进行碱基切除修复（BER）。新的研究正利用这一手段，研发出更为直接的靶向去甲基化工具。

TeresaRoldán-Arjona（西班牙科尔多瓦大学）实验室的团队将一个失活的Cas9（dCAs9）蛋白融合到ROS1的活性域中（dCas9-ROS1），并将其与甲基化构建载体一起转染到HEK293细胞中，发现：

dCas9-ROS1能够以一种浓度依赖性的方式重新激活甲基化沉默的荧光素酶基因的表达。

然而，它无法重新激活完全甲基化的质粒。

相反，无论在任何甲基化水平下，融合到TET1活性结构域的dCas9（dCas9-TET1）都无法重新激活荧光素酶。

dCas9-ROS1还可以重新激活甲基化沉默的GFP构建载体，但效率不如传统的dCas9-p300或dCas9-VP160激活因子。

这三种构建载体都不能重新激活甲基化水平为90%的GFP构建载体。

与单独转染每个构建载体相比，与其他构建载体共转染dCas9-ROS1实际上降低了萤光素酶活性。

与其他靶向下游BER因子共转染dCas9-ROS1不能提高其重新激活甲基化荧光素酶构建载体的能力。

活性dCas9-ROS1转染可降低荧光素酶表达构建载体启动子及启动子附近多个CpGs的甲基化水平。

有趣的是，dCas9-ROS1还增加了未甲基化荧光素酶构建载体的表达，这意味着即使是新转染的结构也会受到从头甲基化的影响，或者dCas9-ROS1除了是去甲基化酶之外，还有激活因子的活性。这种更直接的靶向去甲基化途径，将会有更多的机会运用到哺乳动物去甲基化实验中。