水务看点 | 军团菌来袭，酶底物法检测让其轻松现出原形 / 开普饭

据美国有线电视新闻网8月7日报道，美国疾病预防和控制中心表示，在亚特兰大几栋办公大楼的供水系统发现了军团菌。

CNN报道截图

不仅如此，在此之前美国多地曾检测出军团菌。7月中旬，加利福尼亚州一家度假酒店报告称，在停业期间，酒店自来水的军团菌检测结果呈阳性。7月1日，俄亥俄州凯特林市一学校员工被诊断出军团病。随后该校园有四处地点均检测出军团菌。7月，宾夕法尼亚州西切斯特大学校园建筑物中也发现了这种细菌。6月底，密歇根州布卢姆菲尔德希尔斯一家疗养院也出现一例军团病病例。

疫情期间，又出现军团菌，实在令人担忧。但很多人对军团菌并不是很了解，对其检测方法并不熟知，以及建筑供水系统的条件对其的存在水平与影响因素也不掌握。

什么是军团菌？

军团菌病是一种广泛存在于自然界中的机会致病菌，能引起以发热和呼吸道症状为主的疾病称军团菌病。通常存在于湖泊和溪流等淡水环境中，可在大型供水系统建筑中繁殖。

图片来源于网络

建筑供水系统中军团菌的存在水平

军团菌病首次爆发于 1976 年美国费城的退伍军人大会，182 例感染者中有 28 例死亡，传染源为受军团菌污染的水体。2014 年，美国弗林特市军团菌病爆发，疾病爆发前弗林特市进行了水源切换，其后当地居民军团菌病发病率增加了6.3倍。疾病爆发期间，发病率随饮用水中的游离氯浓度降低而升高，且当居民将龙头水煮沸使用后，军团菌病逐渐平息，表明军团菌病传染源为生活饮用水。英国传染病监控中心报道，在1982年—1990年，208例医院内获得性军团菌感染病例中死亡人数达 68 例，感染源头为医院内的建筑供水系统。龙头水被军团菌污染的现象在全球各国普遍存在，德国 Volke 等对 419 座建筑的108 288 个龙头水采样分析，发现军团菌数量为合格率最低的一项指标［当地标准为 100 CFU /( 100mL)］。Barna等对匈牙利地区 168 栋建筑内部给水系统的水箱、龙头、淋浴器出水进行采样分析，军团菌检出率为61%。表1对近15年军团菌在世界各地区、不同类型建筑供水系统中的检出情况进行了总结。

建筑供水系统中军团菌的影响因素

（1）

水温

军团菌在 20 ～ 50 ℃的水温中可以存活最适生长温度为 35 ～ 46 ℃。当水温为 46 ℃ 时，龙头水中军团菌检出率最高。建筑热水系统的水温一般在 40 ～ 60 ℃， Barna等的研究表明，当水温＞50℃ 时，军团菌检出率出现明显下降的趋势; Bargellini等发现，当温度＞55℃时，水中军团菌的数量与温度呈现负相关。军团菌可进入VBNC状态，而VBNC状态的军团菌不具有繁殖和感染能力，Meier等的研究显示，11℃时，生物膜中的军团菌均处于 VBNC 状态;但在37℃时，可培养的军团菌仍能在生物膜中得以生存。综上，增加热水的温度有利于控制军团菌的繁殖，而降低冷水系统的水温也可以减少军团菌污染的风险。

（2）

氯浓度

军团菌对氯具有耐受性，龙头水中的嗜肺军团菌氯消毒CT99. 9%值(杀灭 99. 9%的细胞所需时间和浓度的乘积) 是大肠杆菌的 580 倍，且从贫营养的环境中分离出的嗜肺军团菌耐氯性高于在富营养培养基中生存的菌株。Marchesi 等分别对未经氯消毒处理和经过氯消毒处理的热水系统水箱水、龙头水进行检测，发现氯消毒前后采样点军团菌检出率分别为 87%和 53%;但氯消毒后嗜肺军团菌在检出点中所占比例更高，表明氯消毒并不能完全杀灭军团菌，且具有致病性的嗜肺军团菌耐氯性更强。因此，在建筑供水系统管道末端、贮水池和热水水箱中，由于余氯衰减和长时间滞留，未被杀灭的军团菌具有进行再生长的可能。

（3）

停留时间

通过检测高使用频率和低使用频率龙头的出水，发现军团菌在使用频率较低的龙头出水中检出率较高，这与龙头使用频率较低导致的长时间停留有关。

（4）

建筑供水系统形式

不同的建筑供水系统形式对军团菌存在水平影响的研究较少。目前的研究表明单设地下水池给水系统的军团菌浓度高于单设屋顶水箱给水系统中的军团菌浓度；无负压供水与高位水箱供水系统水质安全性存在差异。

（5）

生物膜

军团菌可在管道管壁生物膜中存活，生物膜中的军团菌大部分以 VBNC 状态存在。军团菌在生物膜中的存在水平高于管道中的水。荷兰Van等对3座医疗机构、2座宾馆共计10个采样点的龙头水及生物膜进行检测，生物膜中军团菌检出率为70%，水中军团菌检出率为 50%。Waak等认为，龙头水军团菌污染源为市政管网的生物膜，当市政管网管壁生物膜中的军团菌脱落释放到水中，并随着管网输送进入建筑供水系统，在温度升高，且消毒剂余量低的环境条件下，军团菌可能会进行再生长，从而增加感染风险。具有致病性的嗜肺军团菌有很强的形成生物膜能力，温度为32～42 ℃ 时生物膜中细菌的繁殖速度快于在25℃ 时的繁殖速度。因此，附着于建筑热水管道生物膜中的嗜肺军团菌存在更高的再生长风险。

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建筑供水系统典型条件致病菌存在水平及影响因素

盛东方¹，李伟英¹，李悦¹，黄圣洁¹，秦升益²
( 1．同济大学环境科学与工程学院，上海 200092; 2．北京仁创科技集团有限公司，北京 100085)

非饮用水中嗜肺军团菌的检测方法比较

4.1

酶底物法

（1）样本处理与培养

根据Legiolert说明书进行。在无菌微管中加入1mL Legiolert 预处理液及1 mL样品，涡旋混匀后室温下温育1 min，转移至100 mL 溶解的Legiolert试剂中，充分混合并倒入Legiolert 量盘，用SealerPlus 程控定量封口机密封。

将密封好的Legiolert定量盘纸侧向下置于(37±0.5)℃培养箱中，培养7 d。7 d后，定量盘中棕色孔或浑浊孔即为阳性孔。

（2）阳性孔确证试验

为了检验酶底物法的特异性，对Legiolert定量盘中阳性孔进行确证试验。Legiolert定量盘共有6个大孔，90个小孔。如果阳性孔数小于10个，全部进行确证；如果阳性孔数大于10个，先选取10个(包括全部大孔及随机选取的小孔)，再加上随机选取剩余阳性孔数的 25%进行确证。确证方法为使用无菌注射器抽取10 μL悬浮液，涂布BCYE和L-半胱氨酸缺失的 BCYE，35 ~ 37 ℃培养48 ~ 72 h,在BCYE上生长、L-半胱氨酸缺失的BCYE 上无生长的菌落进行生化鉴定、血清型别鉴定及real-timePCR 鉴定。

(3)酶底物法的计量结果

酶底物法采用MPN法确定样本中嗜肺军团菌含量，计算阳性大孔和小孔的数目，并从 LegiolertMPN 表获得所得MPN值。MPN是应用概率理论来估算细菌浓度，实际菌落数有可能落在置信区间内的任何一点，MPN值是落在这个置信区间内概率最大的一点。

4.2

过滤培养法

(1)过滤、洗脱、前处理

依据GB / T 18204. 5—2013，使用六联不锈钢微生物过滤系统对非饮用水样本进行过滤处理。抽滤完成后，取下滤膜置于15 mL灭菌水中充分洗脱,洗脱液在培养前进行酸处理与热处理。

(2)接种与培养

取酸处理样品、热处理样品各0. 1 mL接种GVPC。于35 ~ 37 ℃、2. 5% CO₂环境中培养10 d。24 内长出的为非嗜肺军团菌，24 h后长出的为可疑嗜肺军团菌，继续鉴定。

(3)菌落验证

选取可疑菌落，如果数量小于10个则全部选取；如多于10个，则选取10个及超过10个数量的25%。将选取菌落接种 BCYE 和 L-半胱氨酸缺失的BCYE，35 ~ 37 ℃培养48 h,在BCYE上生长、L-半胱氨酸缺失的BCYE上无生长的菌落继续进行生化鉴定、血清型别鉴定 real-time PCR 鉴定。

(4)结果判定

定性结果：酸处理与热处理后的培养结果，只要有一种方法培养出嗜肺军团菌，即判断该样本含有嗜肺军团菌。定量结果：酸处理与热处理后的培养结果，选取菌落数量较大值为该样本定量结果。

4.3

检测结果对比分析

（1）定性结果

两种方法对84件非饮用水样本进行检测。结果显示，两种方法均阳性样本15件，均阴性样本56件；两种方法相结合，共有28件样本分离出嗜肺军团菌，其中，3件样本只在过滤培养法中有检出，10 件样本只在酶底物法中有检出(表2)。

表2 酶底物法与过滤培养法检测嗜肺军团菌的结果

（2）特异度与灵敏度

本研究对酶底物法和过滤培养法的阳性样本均进行了确证，无假阳性。因此，两种方法特异度均为100%。将检出的嗜肺军团菌的全部样本定义为真阳性样本(28件)，酶底物法和过滤培养法的灵敏度分别为 89. 29%(25 / 28)和 64. 29% (18 / 28)。结果显示，酶底物法灵敏度高于过滤培养法。

（3）两种方法对不同样本的检测结果

表3 两种方法在不同种类样本中检出嗜肺军团菌的样本数量

（4）两种方法对不同血清型别嗜肺军团菌的检出结果

表 4 两种方法检测嗜肺军团菌的血清型别分布

（5）两种方法对嗜肺军团菌检测的定量结果

28个样本经过滤培养法和/ 或酶底物法检出嗜肺军团菌，其定量结果计算原理并不相同。过滤培养法根据GVPC上生长菌落数量计算样本中的 CFU含量。酶底物法根据定量盘中变为棕色或出现浊度的大孔和小孔的数目，Legiolert MPN表获得所得的 MPN 值，MPN 值则是应用概率理论来估算细菌浓度，但并不能表示实际菌落数。本研究采用皮尔逊相关分析法对28对定量结果进行统计分析(图1)。结果显示，两种方法获得的嗜肺军团菌的定量结果具有相关性(皮尔逊相关系数为 0. 718， P =0. 000)。